[发明专利]一种人源化抗人PD-1单克隆抗体及其制备方法、用途与药物

说明书

本发明公开的一种人源化抗人PD‑1单克隆抗体，重链可变区VH氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，制备上述抗体的方法，包括(1)提取杂交瘤细胞的cDNA；(2)克隆重链可变区VH和轻链可变区VL；(3)VH和VL分别与克隆载体连接；(4)菌落进行基因序列测序鉴定；(5)保留比对正确的重轻链可变区序列；(6)扩大培养；(7)转染真核表达细胞株293；(8)去除上清液中杂质并过滤除菌；还公开了抗体的用途及药物，抑制活化T细胞体外增殖，和/或抑制活化T细胞分泌相关细胞因子。本发明的优点在于，丰富了抗体的类型，该抗体可以用于阻断PD‑1/PD‑L1负性信号，促进T细胞增值，激活T细胞生物学功能。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体为一种人源化抗人PD-1单克隆抗体及其制备方法、用途与药物。

背景技术

PD-1(CD279)作为负性共刺激分子受体，诱导性表达在活化的T、B和NK等细胞，PD-1有PD-L1(B7-H1，CD274)和PD-L2(B7-DC，CD273)两个配体。虽然PD1具有与CTLA-4相似的结构，但是二者生物学功能及特异性不同。CTLA-4在T细胞活化初期调控其功能，而PD-1则抑制活化后期T细胞的免疫应答。研究发现，PD-1/PD-L1抑制途径与肿瘤的发生、发展密切相关。肺癌、肝癌、乳腺癌、鳞状细胞癌及卵巢癌等肿瘤细胞株和肿瘤组织组成性高表达PD-1的配体PD-L1，PD-1/PD-L1抑制途径对CD8⁺T细胞的活化增殖有明显的抑制作用，肿瘤细胞可通过诱导此类抑制性受体逃避CTL杀伤作用，减弱机体抗肿瘤免疫应答。通过特异性阻断PD-1/PD-L1抑制信号可使机体中失能的效应性免疫细胞恢复生物学功能，促进肿瘤和病毒特异性CD8⁺T细胞的活化增殖与细胞因子的分泌，增强淋巴细胞对肿瘤抗原、外来入侵的病毒等的杀伤力，提高机体免疫力及时清除肿瘤细胞和病毒。PD-1/PD-L1有望成为肿瘤免疫治疗的有效靶分子。在针对晚期黑色素瘤的研究中，PD-1单抗联合百时美施贵宝已上市的Yervoy(Ipilimumab)治疗12周，可使患者黑色素瘤缩小80％以上，联合用药的疗效明显优于单独使用Yervoy。目前，很多学者都在积极研究抗PD-1抗体对癌症的治疗作用，但抗人PD-1抗体在国内仍处于临床试验阶段，从国外购买成本较高，且有一定的适应症范围。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种人源化抗人PD-1单克隆抗体及其制备方法、用途与药物，实现的目的为，提供一种能产生所述抗人PD-1单克隆抗体的重链、轻链可变区序列，丰富抗人PD-1抗体的类型，使之在商业市场上流通，打破人源化抗人PD-1抗体行业领域发展的瓶颈，同时也为抗人PD-1抗体对各种癌症的治疗作用提供试验材料，推动治疗癌症疾病行业的发展。

为了实现上述目的，本发明公开的技术方案为：本发明提供的一种人源化抗人PD-1单克隆抗体，所述人源化抗人PD-1单克隆抗体的重链可变区VH，其氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示，所述人源化抗人PD-1单克隆抗体的轻链可变区VL，其氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。流式检测表达单抗与L929/PD-1转基因细胞结合良好，阳性率达95％以上。

进一步的，所述重链可变区VH具有三个高变区CDR1、CDR2、CDR3，CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示。

所述轻链可变区VL具有三个高变区CDR1、CDR2、CDR3，CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示。

本发明还提供了制备上述单克隆抗体的方法，包括如下步骤：

(1)提取XGMHc5.1杂交瘤细胞的cDNA；

(2)设计上下游引物PCR克隆该杂交瘤细胞基因序列中重链可变区VH和轻链可变区VL；