[发明专利]一种草莓盐胁迫相关基因FvDIV及其应用

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学、基因工程技术领域，具体涉及一种草莓盐胁迫相关基因FvDIV及其应用。

背景技术

草莓多年生草本植物，属于蔷薇科草莓属，浆果类果树(林凤起，1986)。草莓果实为假果，由花托发育而成(雷家军，2006)。草莓果实色泽红嫩诱人，口感柔软多汁，独具风味，具备很高的营养价值及药用价值，素有“水果皇后”之称，广受大众欢迎(万清林，1994)。

植物对非生物逆境(干旱、冷害、高盐碱等)的适应性对于作物的产量和品质有着非常重要的影响，在许多地区是农业发展的瓶颈。由于北方地区草莓的种植是在日光温室中进行的，因而低温和盐碱胁迫一直是困扰设施草莓发展的瓶颈问题，但目前在草莓中还没有真正可用于抗逆遗传改良的基因。

在植物体内，通过转基因技术，过表达或干扰某个基因可以提高植物对环境胁迫的抗性。在烟草中，过表达精氨酸脱羧酶基因，进而提高植物体内多胺水平，增强了烟草对干旱胁迫的抗性(li et al.2017)。有研究报道，在拟南芥过表达GmWRKY20基因，提高了拟南芥中ABA含量，从而提高了拟南芥的抗旱性(luo et al.2013)。另有研究表明，在对模式植物金鱼草的研究中发现DIVARICATA(DIV)RADIALIS(RAD)、DICHOTOMA(DICH)共同参与两侧对称花型发育的分子调控(魏海超等，2012)，但有关DIVARICATA基因在植物耐盐过程中的作用鲜有报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种草莓盐胁迫相关基因FvDIV及其应用。本发明的技术方案是从二倍体森林草莓‘Ruegen’中分离得到FvDIV基因，构建该基因的植物过表达载体，通过农杆菌介导法，将该基因转化到拟南芥中，以实现FvDIV基因的功能分析。

本发明提供了一种草莓盐胁迫相关基因FvDIV，该基因的cDNA序列如SEQ NO.1所示；草莓盐胁迫相关基因FvDIV编码的蛋白质，所述基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；本发明还提供了一种含有草莓盐胁迫基因FvDIV的植物表达载体pRI101-GFP-CaMV35S-FvDIV，将其通过农杆菌介导法转入拟南芥中。

实际上，任何一种将外源基因导入植物体内的表达载体都可以用，本发明优先选用的是的pRI101-GFP-CaMV35S。

本发明的有益效果是：利用现有植物基因工程技术，本发明克隆了草莓耐盐相关基因FvDIV，并通过农杆菌介导的方法将该基因转入拟南芥，经过比较分析证明，转基因植株的耐盐胁迫明显提高。

附图说明

图1：FvDIV基因全长cDNA序列的扩增结果。其中M为DL2000

图2：pRI101-GFP-CaMV35S-FvDIV重组载体验证结果。其中M为DL2000

A：为Kpn1和EcoR1对pRI101-GFP-CaMV35S-FvDIV重组载体双酶切验证结果。

B：为转化了的pRI101-GFP-CaMV35S-FvDIV农杆菌的菌落PCR结果。

图3：pRI101-GFP-CaMV35S-FvDIV测序比对结果。

图4：转基因拟南芥抗性筛选。

图5：为盐胁迫下转基因植株的生长状况。其中，WT为转化的拟南芥，Line8/Line19为两个独立的转基因株系。

图6：FvDIV与其他物种氨基酸序列比对结果

具体实施方式：

实施例1、草莓盐胁迫基因FvDIV的克隆

(1)以二倍体森林草莓‘Ruegen’为试材。

(2)RNA提取：采用改良CTAB法，提取材料中的总RNA之后用反转录试剂盒以RNA为模板反转录得到cDNA第一链。

(3)基因的克隆：以反转录的果实cDNA第一链为模板，利用引物FvDIV-F和FvDIV-R进行PCR扩增，回收PCR产物，获得939bp的目的片段。

FvDIV-F：5＇－AAAGGTACCATGTATAGGGGAATTGAAGTTC－3＇

FvDIV-R：5＇－AAAGAATTCCTGATATTGCATCTCGAAACGC－3＇

其中，引物5＇端的前3个碱基为保护碱基，紧接着的6个碱基是酶切位点，5＇端前9个碱基是构建过表达载体所需，不属于FvDIV的基因序列。

实例2、植物表达载体的构建