[发明专利]细胞角蛋白19片段的板式化学发光法检测试剂盒及制备方法

权利要求书

1.一种细胞角蛋白19片段的板式化学发光法检测试剂盒，其特征在于：包括的试剂：生物素标记的CYFRA21-1抗体溶液、抗生物素抗体包被的酶标板、辣根过氧化物酶标记的CYFRA21-1抗体溶液、CYFRA21-1校准品A-F、浓缩洗液、底物液A、底物液B；

试剂盒的制备方法，包括如下步骤

一、浓缩洗液的配制，步骤如下：

1、称取KCl 60g、NaCl 300g于1L 容器中；

2、称取20.0g Tween-20 于100ml 容器中加50ml 水使其完全溶解后，倒入上述1L 容器中；

3、用移液器将Proclin-300 量取2ml，倒入上述1L 容器中；

4、用量筒量取适量纯化水于上述1L 容器中，充分搅拌直至完全溶解；

5、调pH，控制其范围在7.35～7.45 之间；

6、最后定容至1000ml，完全溶解后用0.2μm 滤器过滤即得；

二、底物液的配制

（一）底物液A 的配制步骤

1、称取硼砂11.44g、硼酸4.948g、鲁米诺2.0g 和对碘苯酚0.2mg 于1L 烧杯中；

2、用量筒量取纯化水于1L 烧杯中，充分搅拌直至完全溶解，调pH，控制其范围在7.95-8.05 之间；

3、用0.2μm 滤器过滤收集滤液，用纯化水定容至1000ml，混匀后即得；

（二）底物液B 的配制

1、称取硼砂11.44g、硼酸4.948g、过氧化脲0.2g 和PC300 500μl 于1L 烧杯中；

2、用量筒量取纯化水于1L 烧杯中，充分搅拌直至完全溶解，调 pH 控制其范围在7.95-8.05 之间；

3、用0.2μm 滤器过滤收集滤液，用纯化水定容至1000ml，混匀后即得；

三、校准品稀释液的配制方法，步骤如下：

1、称取Tris 12.11g 和HCl 7 ml 于1L 的容器中，调节溶液pH, 控制其范围在7.35-7.45 之间, 定容至1000ml ；

2、用量筒量取小牛血清300ml，加入上述溶液中，作为校准品稀释液备用；

四、校准品的配制方法，步骤如下：

1、校准品A的配制：取校准品稀释液，分装到适宜规格；

2、校准品B的配制：取校准品稀释液，将CYFRA21-1溶液稀释适宜倍数，控制浓度为1ng/mL，分装到适宜规格；

3、校准品C的配制：取校准品稀释液，将CYFRA21-1溶液稀释适宜倍数，控制浓度为5ng/mL，分装到适宜规格；

4、校准品D的配制：取校准品稀释液，将CYFRA21-1溶液稀释适宜倍数，控制浓度为20ng/mL，分装到适宜规格；

5、校准品E的配制：取校准品稀释液，将CYFRA21-1溶液稀释适宜倍数，控制浓度60 ng/mL，分装到适宜规格；

6、校准品F的配制：取校准品稀释液，将CYFRA21-1溶液稀释适宜倍数，控制浓度为120ng/mL，分装到适宜规格；

五、抗生物素抗体包被的酶标板

1、配制0.01M的碳酸缓冲液，调节pH至pH9.6±0.1，备用；

2、在上述0.01M的碳酸缓冲液中加入抗生物素抗体溶液至终浓度为0.2～8μg/ml，搅拌30分钟至混合均匀；

3、将上述混匀后的溶液按包被量为100 μL每孔加入酶标板中，采用高温振荡式包被，包被温度为37±1℃，包被时间为1～3小时，采用低速振荡包被形式，振荡幅度与方式：3mm，采用水平回转，转速为200～500rpm；

4、配制0.1M ，pH7.4TBS缓冲液，含0.3%BSA，1%羊血清，0.1% Proclin300(v/v)，1%鱼皮明胶，2%海藻糖和10%蔗糖，作为封闭液加入到清洗后的包被板中，封闭量为150μL每孔，封闭温度为37±1℃，封闭时间为2～5小时；

5、吸掉封闭液，放置在干燥箱中，干燥温度控制在37±1℃，干燥时间为2～4小时，再以铝箔袋真空包装，贴签备用；

六、辣根过氧化物酶标记CYFRA21-1抗体溶液的制备

（一）酶反应物稀释液的配制

1、取Tris 4.846g、HCl 2900μl 于烧杯中，然后在烧杯中加入纯化水，充分搅拌使试剂完全溶解；

2、调pH，控制 pH 在 7.35-7.45 ；

3、称取BSA 1g 倒入上述烧杯中；

4、最后烧杯定容至400ml，用0.2um 滤器过滤即得；

（二）辣根过氧化物酶 （HRP）与CYFRA21-1抗体的偶联

1、取抗CYFRA21-1抗体1mg 放置于1ml 玻璃管中；

2、取200μl DMSO 溶解抗体使抗体的终浓度到达5mg/ml，然后充分混匀；

3、按照1mol 抗体加入10mol 的辛二酸二琥珀酰亚胺酯的摩尔比例加辛二酸二琥珀酰亚胺酯到上述步骤2得到的溶液中，37℃恒温箱中反应 1.5 小时；

4、按照3mol 抗体加入1mol HRP的摩尔比往上述步骤3得到的溶液中添加HRP，然后加入1ml 的pH 为7.4 浓度为0.1M 的PB 缓冲液，置于 37℃恒温箱中反应 3小时；

5、将上述步骤4 配制的溶液用PD-10 柱纯化，收集纯化液，按照1:3000 的体积添加酶反应物稀释液，控制最终使用浓度在0.02-3.0μg/ml，混合均匀即得酶反应物；

七：生物素标记的CYFRA21-1抗体溶液的制备

（一）生物素反应物稀释液的配制

1、取Tris 4.846g、HCl 2847μl 于烧杯中，然后在烧杯中加入纯化水，充分搅拌使试剂完全溶解；

2、调pH，控制 pH 在 7.35-7.45 ；

3、称取BSA 1g 倒入上述烧杯中；

4、最后烧杯定容至400ml，用0.2μm 滤器过滤即得；

（二）取生物素化抗体，以生物素反应物稀释液稀释，控制最终使用浓度在0.01～1.0μg/ml，混匀，即可得到生物素结合物。