[发明专利]一种人急性胰腺炎小鼠模型的构建方法

说明书

本发明公开了一种人急性胰腺炎小鼠模型的构建方法。构建含有PRSS1基因的打靶载体质粒，将含有PRSS1基因的打靶载体质粒电转入小鼠胚胎干细胞，得到携带有重组PRSS1基因的小鼠胚胎干细胞；将携带有重组PRSSS1基因的小鼠胚胎干细胞显微注射入白化的小鼠囊胚期细胞中，将注射完毕后的囊胚期细胞移入假孕母鼠子宫内待产，移植后获得嵌合鼠；将嵌合率50％的雄性嵌合体小鼠与野生型C57BL/6J雌性小鼠合笼，繁殖产生下一代小鼠，筛选携带有PRSS1基因的小鼠。模型小鼠的表型与人胰腺炎的发病过程非常吻合，从而得到一个从基因到表型完全模仿人胰腺炎的特异动物模型，可进一步广泛用于人PRSS1的致病病因、病理机制等研究，以及对胰腺炎治疗药物的筛选和基因治疗试验等。

技术领域：

本发明属于动物模型构建领域，具体涉及一种人急性胰腺炎小鼠模型的构建方法。

背景技术：

急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)是一种临床上常见，且具有潜在致命危险的急腹症。尽管对AP的诊治取得了很大进展，但病死率仍在10％左右，重症患者达50％。其中最重要的原因在于，AP的初始化的具体机制并未被完全认识，也就无从指导新的、更有效的治疗胰腺炎药物的开发。近20多年来，大量的、基于实验性胰腺炎动物模型的研究发现腺泡细胞内胰蛋白酶原(trypsingen)过早激活在AP初始化过程中起到了关键作用。但是关于trypsingen活化的具体机制及其在胰腺炎发展过程中的作用地位尚未得到明确解释。造成目前胰腺炎领域研究迟滞不前的重要原因在于：缺乏理想的实验动物模型来完成体内试验。

目前，有以下几种实验性急性胰腺炎的动物模型被广泛使用，包括雨蛙素注射、胰管结扎、胆盐胰管逆行灌注、乙硫氯酸饮食以及精氨酸注射等方法。这些动物模型在很大程度上加深了我们对急性胰腺炎早期腺泡损伤机制的认识。然而，这些动物模型在诱发胰腺炎的过程中往往会产生非特异性的表现，而不是针对胰蛋白酶原特异性的激活。并且在过去40年里，超过70例的临床试验并没有发现明确的实验证据：抑制胰蛋白酶(Trypsin，为trypsingen活化产生)激活可以改善胰腺炎的发病过程。针对临床与动物实验结果的不一致性的最大可能就是现有的动物模型并不适合研究腺泡内胰蛋白酶原的激活在胰腺炎起始发病阶段中的作用，以及检测潜在性的药物对于胰腺炎治疗和保护的作用。因此，新型的动物模型亟需构建用来研究胰腺炎起始过程中胰蛋白酶的作用，而转基因动物为基础研究及新药的开发带来了可能。

Saluja等利用基因敲除的方法建立了敲除trypsingen异质体表达基因(为小鼠的基因)的转基因小鼠，并进行了初步研究。与传统观点不同在于，他们认为：腺泡内胰蛋白酶原的活化导致了AP早期腺泡的坏死，这些损伤占到了AP50％的损伤。但是，AP局部及全身的炎症反应，以及慢性胰腺炎的进展并不需要trypsingen的活化。 N等人制作了表达人野生型PRSS1基因的转基因小鼠进行研究，他们认为：PRSS1基因的表达促进了小鼠腺泡细胞的凋亡，并且可以存进自发性胰腺炎的发生。上述两种实验结论部分相悖，分析其原因在于所使用的转基因小鼠存在缺陷：用于表达目的基因的启动子都是大鼠源性的弹性蛋白酶，而不是人源性的弹性蛋白酶，因此从根本上对于实验结果的可信性存在质疑。理想状态的AP转基因动物模型除了要将人阳离子胰蛋白酶原基因定位表达于胰腺腺泡细胞，同时必须使用人源性的弹性蛋白酶作为启动子。

发明内容：

本发明的目的是提供一种人急性胰腺炎小鼠模型的构建方法，利用本发明的方法构建得到的人急性胰腺炎小鼠模型，符合人阳离子胰蛋白酶原基因定位表达于胰腺腺泡细胞，同时必须使用人源性的弹性蛋白酶作为启动子，并且其表型与人急性胰腺炎的发病过程十分相似，因而是一种非常好的人急性胰腺炎的疾病模型。

本发明的人急性胰腺炎小鼠模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：