[发明专利]抗FOXP3蛋白单克隆抗体及其用途

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及可特异结合FOXP3蛋白的单克隆抗体UMAB248、产生所述单克隆抗体的细胞株及应用该抗体用于诊断的方法和用途。

背景技术

叉头样转录因子3(fork head box protein 3,FOXP3)是脊椎动物叉头样转录因子家族中的一员,由Brunkow等在2001年首次报道。于2003年被证实为CD4+CD25+调节性T细胞(regulatory T cell,Treg)的特异性标志。高表达于免疫系统中“主动”机制(由一群功能上起抑制作用的细胞介导的耐受机制)的CD4+CD25+Treg细胞中，FOXP3+CD4+CD25+Treg细胞在肿瘤免疫逃逸机制中发挥作用,并先后在黑素瘤、胰腺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、肺癌等肿瘤中检测到FOXP3的高表达。并有研究证实,FOXP3表达的高低可作为评价治疗效果和有无复发转移的一个很有意义的指标。

临床上常用免疫组织化学(IHC)病理实验检测肿瘤细胞中蛋白的表达状况，然而IHC实验的核心为特异性结合蛋白的单克隆抗体，其性能的优劣直接决定着整个检测的灵敏度和特异性。因此，研制出一种结合特异性较高的针对FOXP3蛋白的单克隆抗体对IHC检测FOXP3表达水平具有重要的意义。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种结合特异性较高的FOXP3蛋白的单克隆抗体，及其在制备用于检测FOXP3蛋白的免疫检测工具中的应用。

本发明提供了一种杂交瘤细胞株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称为CGMCC)，保藏日期为2017年4月6日，保藏编号为CGMCC No.13823。

本发明还提供了一种特异性结合FOXP3蛋白的单克隆抗体UMAB248，由上述杂交瘤细胞株产生。

本发明所述单克隆抗体的制备方法如下：

(1)重组表达载体的构建：根据FOXP3 ORF核苷酸序列(FOXP3 ORF核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，1296bp；FOXP3氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示)

设计引物PCR扩增FOXP3 ORF第1bp位到第1296bp位序列，基因两侧分别引入限制性内切酶位点SgfI和MluI，插入表达载体pET23a-N-His，构建FOXP3氨基酸序列第1位到第431位的重组表达质粒pET23a-rFOXP3；上游扩增引物序列，SEQ ID NO.3:CACGCGATCGCATGCCCAACCCCAGGCCTG下游扩增引物序列SEQ ID NO.4:ACCGACGCGTTCAGGGGCCAGGTGTAGGGT

(2)FOXP3重组蛋白的表达与纯化：将FOXP3重组表达质粒转化E.Coli细胞，裂解离心获得上清，镍柱亲和层析柱纯化，获得纯化的FOXP3重组蛋白；

(3)单克隆抗体的筛选与制备：采用上述纯化的FOXP3重组蛋白免疫Balb/c小鼠，取小鼠脾脏细胞与SP2/0细胞进行融合，有限稀释法获得单克隆，ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞，获得能分泌抗FOXP3特异性抗体的杂交瘤细胞株，命名为UMAB248，亚型鉴定为IgG1；通过无血清培养基制备抗体，通过亲和层析柱纯化获得FOXP3单克隆抗体UMAB248。分别通过Western Blot、免疫组化实验验证该单克隆抗体的灵敏度和特异性。

本发明还提供了单克隆抗体UMAB248在制备用于检测FOXP3蛋白的免疫检测工具中的应用。

具体地，所述免疫检测工具为试剂盒、芯片或试纸。

在具体的实施例中，本发明提供了一种免疫组化检测试剂盒，包括上述单克隆抗体UMAB248，可检测组织细胞中FOXP3的表达状况。

本发明还提供了上述单克隆抗体在制备用于标记肿瘤的试剂盒中的应用。其中所述肿瘤具体是指肿瘤细胞的增殖与FOXP3的表达密切相关的肿瘤，包括但不限于黑素瘤、胰腺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、肺癌。