[发明专利]衍生化HPLC－DAD法测定药物中小分子脂肪胺的方法

说明书

技术领域

本发明属于药品分析检测领域，涉及衍生化HPLC-DAD法测定小分子脂肪胺的方法，尤其涉及衍生化HPLC-DAD法测定药物中小分子脂肪胺的方法。

背景技术

小分子有机胺是指有机类物质与氨发生化学反应生成的小分子有机化合物。除了工业生产外，蛋白质、氨基酸和其它含氮化合物通过微生物发酵降解也会产生相应的小分子有机胺。小分子有机胺因具有较强的碱性和反应活性，在化工和制药领域应用广泛，经常作为药物合成中的有机溶剂、原料和中间体。胺类物质往往具有鱼腥气味或氨的刺激气味，对皮肤、呼吸道、黏膜及眼睛具有强烈刺激作用；而且大部分都有毒性，有的甚至是“三致”物质：文献表明，仲胺(二甲胺、二乙胺等)可与体内存在的亚硝酸根离子反应形成致癌的亚硝胺，从而对人体健康造成威胁。另外，临床上将检测二甲胺的含量作为诊断遗传性代谢性紊乱疾病的重要指标。为了保证药品的安全性，应严格对药品合成过程中可能引入的相关杂质进行质量控制。因此建立高效、简便而灵敏的分析方法对药品中的这类物质进行监控显得尤为重要。

药物中小分子脂肪胺的分析方法的建立存在着诸多的挑战。首先，小分子脂肪胺极性大，挥发性强，结构上缺少紫外发色团或荧光基团，采用一般的分析方法难以对其进行检测；其次，大量药物基质的存在势必产生较强的干扰，因此要求分析方法应具有极高的专属性和灵敏度；再者，由于基质成分的复杂性，药物分析时无法经历复杂的浓缩富集过程以防止药物析出结晶；最后，药品检验是常规工作，不能使用昂贵的试剂或繁琐的前处理操作，且最好使用常规的分析仪器以增加方法的普适性。

目前已报道的测定微量脂肪胺的分析方法很多，包括分光光度法、气相色谱法、离子色谱法、衍生化法等，主要针对于环境样本。夏涛将水样中的二甲胺与氯化铜及二硫化碳反应生成黄棕色二甲氨基二硫代甲酸铜，在430nm处测量溶液的吸光度，比色定量。分光光度法操作简便，但是只能测定总胺的含量，专属性差。气相色谱法结合不同的前处理技术(固相微萃取技术、顶空进样技术和溶剂棒微萃取技术)被报道用于水环境中脂肪胺的测定，这些方法经浓缩富集之后直接分析，无须衍生化，灵敏度高；然而胺分子极性大，容易吸附在硅烷和硅氧烷等极性固定相上，造成峰拖尾，重复性差。Ferreira等建立了蒸馏提取-离子色谱法测定海水中残留的铵根离子、甲胺和乙胺，方法的检测限低，回收率良好。然而，考虑到药物合成中存在大量的反簇离子会对实验结果造成干扰，且离子色谱法在药物分析中普适性差，因此并非测定胺类物质的最佳方案。

衍生化法也是测定微量有机胺最常用的分析方法，目前有关胺类物质衍生化法的报道较多，包括衍生化气质联用法、衍生化高效液相色谱法、衍生化毛细管电泳法以及衍生化液质联用法等，这促使了很多衍生化试剂的诞生和发展。氯甲酸-9-芴甲酯、丹磺酰氯、叔丁基溴乙酸乙酯、五氟苯甲醛、1，3，5，7-四甲基-8-(N-羟基琥珀酰亚胺基丁酸酯)-二氟硼酸基-s-吲丹烯等均被用于胺类物质的衍生化分析中。这些衍生化试剂虽然在一定程度上缓解了微量胺类物质难以测定的问题，却存在着不同程度的缺陷，包括基质效应大、衍生化试剂干扰、灵敏度低、选择性差、反应条件苛刻、衍生化试剂难以商品化等。其中过量未反应衍生化试剂的干扰已成为困扰分析学者的主要矛盾之一。衍生化试剂与产物往往具有相似的结构，为了去除过量的衍生化试剂，经常需要结合繁琐的前处理步骤，或者摸索复杂的色谱条件。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供衍生化HPLC-DAD法测定小分子脂肪胺的方法。

本发明的另一目的是提供衍生化HPLC-DAD法测定药品中小分子脂肪胺的方法。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

衍生化HPLC-DAD法测定小分子脂肪胺的方法，包含以下步骤：

(1)在20～60℃下，以非质子极性溶剂为反应溶剂，在弱碱催化剂的催化作用下，使用卤代硝基苯类衍生化试剂对小分子脂肪胺衍生化反应生成在紫外可见光区(350～450nm)有较强的吸收的产物；

(2)以步骤(1)中衍生化反应结束后的反应液作为进样样品，利用HPLC-DAD法，基于反相分配色谱法原理在紫外可见光区(350～450nm)测定其中脂肪胺的衍生化产物，从而实现对小分子脂肪胺的定性或定量检测。