[发明专利]利用高效液相色谱‑荧光检测（HPLC‑FLD）法分析测定燕麦生物碱

说明书

技术领域

本发明涉及利用高效液相色谱-荧光检测(HPLC-FLD)法分析检测燕麦生物碱。燕麦生物碱是一系列N-(肉桂酰)邻氨基苯甲酸类化合物，研究发现，燕麦生物碱提取物具有抗氧化、降血脂、抑制肿瘤细胞增殖、消炎止痒等功能，广泛应用于药品、功能保健品及化妆品领域，但目前没有高效灵敏的检测分析燕麦生物碱的方法，也没有从燕麦中分离纯化得到燕麦生物碱单体化合物，燕麦生物碱检测分析方法的不完善严重阻碍了燕麦生物碱的开发利用，因此，燕麦生物碱的分析检测方法亟待解决。

背景技术

曲尼司特是燕麦生物碱的结构类似物，其化学结构式为N-(3，4-二甲氧基肉桂酰)邻氨基苯甲酸，是一种淡黄色粉末。我们以曲尼司特作为标准参照物，探索N-(肉桂酰)邻氨基苯甲酸类化合物的分析检测方法。

现有检测曲尼司特的方法有两种：紫外分光光度法、高效液相-紫外检测(HPLC-DAD) 法。两种方法都基于曲尼司特的紫外吸收特性，即在330nm下有最大吸收值，但母核侧链上的生色团与助色团会明显影响其紫外吸收，且光谱信息在紫外-可见光谱范围重叠现象严重，都会造成误差，可见，单纯依靠单一检测方法分析曲尼司特具有很大局限性。

本发明的目的是定量分析检测燕麦生物碱，利用该类化合物的荧光特性，以燕麦生物碱的结构类似物曲尼司特作为标准参照物，利用高效液相色谱-荧光检测(HPLC-FLD)技术定量分析检测曲尼司特，利用HPLC-FLD的荧光强度量化曲尼司特浓度，建立曲尼司特 HPLC-FLD的标准曲线，以此来定量分析燕麦生物碱含量。

发明内容

本发明所要解决的问题是检测分析燕麦生物碱。

本发明涉及检测分析燕麦生物碱的方法及其应用，其特征是基于燕麦生物碱的荧光特性，以燕麦生物碱的结构类似物曲尼司特作为标准参照物，建立HPLC-FLD技术定量分析燕麦生物碱的方法。

附图说明

1、曲尼司特是燕麦生物碱的结构类似物，见图1.

2、曲尼司特的荧光性质

图2是曲尼司特在激发波长330nm，38％和50％浓度下的发射全波长图，显示了曲尼司特的荧光特性，即在激发波长330nm下产生430nm发射光。

3、曲尼司特的荧光稳定性：

配制0.1mg/mL曲尼司特溶液，在室温、不避光条件下保存，HPLC-FLD法分析其在40 天内的荧光强度变化，确定其稳定性。表1给出曲尼司特的荧光稳定性。

表1 曲尼司特的稳定性(0.1mg/mL)

4、确定HPLC-FLD定量检测分析曲尼司特的方法

用乙醇配制0.1mg/mL曲尼司特样品溶液进行HPLC-FLD，流动相为62％水(含10mM 乙酸)和38％乙腈等梯度洗脱20min，柱温30℃，进样量10μL，荧光检测条件是激发波长 330nm、发射波长430nm，如图3所示，图4是曲尼司特在330nm下的HPLC-DAD图谱。

5、绘制曲尼司特标准曲线

在激发波长330nm、发射波长430nm条件下，利用HPLC-FLD检测分析曲尼司特。图 5是在浓度范围为10^-9～1.0mg/mL内，曲尼司特的荧光强度与浓度的关系，可见在0～0.1mg/mL 浓度内呈线性关系，图6是曲尼司特的荧光强度与浓度的标准曲线图。

6、检测限

选取两个低于标准曲线线性范围最低浓度0.001mg/mL的曲尼司特溶液即0.0008mg/mL 和0.0009mg/mL进行HPLC-FLD测定，见表2，结果显示0.0008mg/mL和0.0009mg/mL曲尼司特溶液对应的荧光值分别为19.3300EU和21.9327EU，均有明显的响应信号，说明可以运用国际纯粹与应用化学联合会(IUPAC)对检测限的定义计算。取k＝3，此时置信区间为99.6％；以乙醇溶液为空白对照样品，在相同HPLC-FLD检测条件下测定其20次，计算得空白信号的平均值和标准偏差s_b1；根据IUPAC定义计算检测限：

式中，x_L——检测限；——空白均值；k——与置信度有关的常数；s_b1——空白值标准偏差；c_L——最低检出浓度；s——低浓度时的灵敏度，即标准工作曲线在低浓度范围内的斜率。

表2 曲尼司特的检测限

7、回收率