[发明专利]非编码免疫调节DNA构建体

说明书

本发明是申请日为2011年12月23日，申请号为201180067799.0，标题为“非编码免疫调节DNA构建体”的专利申请的分案申请。

发明领域

本发明涉及核酸分子及其在调节免疫系统中的用途。

发明背景

新出现的一种对抗复杂疾病例如癌症、传染病、过敏反应和哮喘的策略是利用患者的免疫系统。已知免疫系统或其活性可以被特定的DNA序列调节。据Krieg等人报道(Nature 1995 374:6522 546-549)，大部分已知的免疫修饰短DNA序列含有未甲基化的胞嘧啶鸟嘌呤基序(CG基序)。与原核生物或病毒相比，在真核生物的基因组中未甲基化的CG基序的出现基本上被抑制。因此，含有该基序的DNA分子已经进化为天然的“危险信号”并且引起免疫系统对原核病原体或病毒病原体的对抗。这可以在治疗上或在预防上用来治疗或预防传染病以及非传染病。

含有未甲基化CG基序的DNA构建体能够通过强烈刺激先天免疫系统的效应细胞从而引发相当的生理效应，所述效应细胞包括树突细胞、巨噬细胞、天然杀伤细胞(NK)和NKT细胞。未甲基化CG基序由先天免疫模式识别受体Toll样受体(TLR)9检测。尽管仍未完全了解其确切的识别机制，在阐明其通路上已经取得了显著进展(A.Krieg,Nat.Rev.Drug Disc.,5:471-484,2006)。假设在含有未甲基化CG的DNA构建体与受体结合后，应答细胞中多重信号级联被激活。通过特征表面分子的上调和细胞因子的分泌，诱导以Th1模式为主的适应性免疫。这样的构建体可以与例如抗体、化学疗法或放射疗法、疫苗或细胞因子组合使用。变应性疾病和哮喘主要是Th2介导的。通过增加Th1/Th2的比例，减弱Th2介导的应答，从而可以治疗或预防这些类型的疾病。

取决于所分析的特定细胞类型，表面分子包括，例如，CD40、CD69、CD80或CD86。不同细胞类型的细胞因子分泌也是特征性的；细胞因子包括，例如，巨噬细胞炎性蛋白质(MIP)-1α、MIP-1β、白细胞介素(IL)-6、IL-8、干扰素(IFN)-α、肿瘤坏死因子(TNF)-α、IFN-γ、单核细胞趋化蛋白(MCP)-1或IFN-γ诱导的10kDa蛋白(IP-10)。

为了预防或治疗疾病，已经证明疫苗接种是非常有效的方法。为了确保强烈而持续的免疫应答，能够刺激抗原呈递细胞例如树突细胞的佐剂通常和抗原一起施用，并且在这个用途上TLR9激动剂已经被证明是有效的免疫刺激剂。

不依赖于任何对未甲基化CG基序影响或调节免疫应答的机制的解释，已经开发了许多方法通过使用这样的基序调节免疫系统。WO 1998/018810公开了当含有未甲基化CG基序的免疫刺激性序列是单链的一部分时，其甚至更有效。然而，由于单链核酸的快速降解，施用开链的单链DNA分子是不可行的。因此，开发了用于保护含有未甲基化CG基序的单链或双链DNA构建体的不同方法。

为了实现对DNA核酸酶降解的抗性，核酸聚合物主链中的磷酸二酯键经常被修饰为硫代磷酸酯。这样的由硫代磷酸酯保护的核酸除了其刺激性活性稍微减少之外，最近几年的临床试验还显示硫代磷酸酯保护的毒性排除或严重限制了这样的核酸在药物组合物或药剂中的任何应用。

另一种保护含有CG基序的DNA序列的方法公开于例如EP 1 196 178。该文件公开了短的脱氧核糖核酸分子，其包含部分单链的、哑铃状的、共价闭合的包含CG基序的核苷酸残基序列(“dSLIM”)。根据EP 1 196 178的公开内容，CG基序位于所公开的分子的双链茎两端处的单链环内或位于所述双链茎内。单链发夹环保护双链茎免受细胞内外的DNA核酸酶的降解。

文件WO 2010/039137公开了免疫调节性寡核苷酸作为TLR介导的疾病的拮抗物，其在免疫刺激性基序的侧翼序列中和/或在寡核苷酸基序中具有一或多个化学修饰，所述寡核苷酸基序在无所述修饰时是免疫刺激性的。因此，WO 2010/039137所公开的寡核苷酸旨在抑制由TLR导致的免疫应答。

WO 2005/042018描述了新的所谓的C-型CpG寡核苷酸，其中c-型寡核苷酸由CpG序列以及富含GC的回文基序表征，所述CpG序列通常位于所述分子的5’或3’末端或其附近，所述富含GC的回文基序通常位于所述分子的另一末端或其附近。该文件公开了c-型DNA的回文序列的变体。

发明简述

针对本领域的状态，本公开的目的在于提供另一种免疫调节DNA构建体，其在转移入真核细胞后是稳定的且避免了有害的副作用。