[发明专利]一种产羟基脂肪酸的工程菌株及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及微生物领域，特别涉及一种产羟基脂肪酸的工程菌株及其制备方法和应用。

背景技术

羟基脂肪酸(HFAs)是脂肪酸分子长链碳位非羧基碳原子上具有单个或多个羟基的一类有机羧酸，广泛存在于植物、动物以及微生物中。近年来研究发现羟基脂肪酸具有一系列的生理作用，如抗菌性、抗炎性和抗糖尿病等。与常规脂肪酸相比，HFAs中羟基的存在使得它们具有一些特殊的性质，如HFAs具有较高的活性、黏性、稳定性和溶剂混溶性，在食品、化工、制药、化妆品等行业具有广泛的用途，尤其是ω-HFAs可以作为合成绿色聚合物材料的理想原料，合成的聚合物能够对高温和化学制品具有耐受力，并具有一定的弹性和较高的生物相容性，安全无毒，因此受到人们的青睐。

自然界中的羟基脂肪酸主要来自蓖麻种子中的蓖麻油酸。但蓖麻种子还含有剧毒物质蓖麻毒蛋白和一些过敏原蛋白，这为栽培、收获、贮运及加工蓖麻带来诸多不便，这使得由自然界中获得的羟基脂肪酸已经远不能满足人们的需求，为了克服上述缺陷，人们采用化学法合成羟基脂肪酸。

在实现本发明的过程中，发明人发现现有技术至少存在以下问题：

化学法合成羟基脂肪酸由于合成的羟基脂肪酸羟基位点特异性差，反应中需要使用强酸强碱因而对环境造成污染等，使化学法合成羟基脂肪酸受到了一定的局限。

发明内容

为了解决现有技术中化学法合成羟基脂肪酸羟基位点特异性差且污染环境的问题，本发明实施例提供了一种产羟基脂肪酸的工程菌株及其制备方法和应用。所述技术方案如下：

一方面，本发明实施例提供了一种产羟基脂肪酸的工程菌株，所述工程菌株包括：P450_BM3基因、硫脂酶基因和脂肪酸调控因子fadR，所述P450_BM3基因的序列如序列表中SEQ ID NO.1所示，所述硫脂酶基因为序列如序列表中SEQ ID NO.2所示，所述脂肪酸调控因子fadR的序列如序列表中SEQ ID NO.3所示。

另一方面，本发明实施例提供了一种制备上述工程菌株的方法，所述方法包括：

将所述P450_BM3基因和所述硫脂酶基因分别连接到第一表达载体上，得到第一重组表达载体。

将所述脂肪酸调控因子fadR连接到第二表达载体上，得到第二重组表达载体。

将所述第一重组表达载体和所述第二重组表达载体共同转入感受态细胞中，得到重组菌株，即所述工程菌株。

具体地，所述感受态细胞为敲除了fadD基因的大肠杆菌感受态细胞。

具体地，所述将所述P450_BM3基因和所述硫脂酶基因分别连接到第一表达载体上，得到第一重组表达载体，包括：

采用限制性内切酶EocRI和限制性内切酶NotI分别对所述P450_BM3基因与所述第一表达载体进行双酶切，将酶切后的所述P450_BM3基因与酶切后的所述第一表达载体连接，得到第一连接产物。

采用限制性内切酶BglII和限制性内切酶XhoI分别对所述第一连接产物和所述硫脂酶基因进行双酶切，将酶切后的所述硫脂酶基因与酶切后的所述第一连接产物连接，得到第一重组表达载体。

进一步地，所述第一表达载体为pACYCDuet-1。

具体地，所述将所述脂肪酸调控因子fadR连接到第二表达载体上，得到第二重组表达载体，包括：

采用限制性内切酶BamHI和限制性内切酶HindIII分别对所述脂肪酸调控因子fadR和所述第二表达载体进行双酶切，得到酶切后的所述脂肪酸调控因子fadR和酶切后的所述第二表达载体，将所述酶切后的脂肪酸调控因子fadR与酶切后的所述第二表达载体连接，得到所述第二重组表达载体。

具体地，所述第二表达载体为载体pET-28a(+)。

又一方面，本发明实施例提供了一种上述工程菌株在合成羟基脂肪酸中的应用，所述应用包括：

活化所述重组菌株。

发酵活化后的所述重组菌株，并加入诱导剂进行诱导，得到诱导产物。

在所述诱导产物中提取羟基脂肪酸，得到所述羟基脂肪酸。

具体地，采用发酵培养基发酵活化后的所述重组菌株，所述发酵培养基为含有抗生素和浓度为0.5％的葡萄糖的M9培养基，其中，所述抗生素包括浓度50μg/mL的卡纳霉素和浓度为34μg/mL的氯霉素。

进一步地，所述发酵培养基还包括浓度为2％的甘油。