[发明专利]一种刺激隐核虫表面蛋白C1多克隆抗体的制备方法及其应用

权利要求书

1.一种刺激隐核虫表面蛋白C1多克隆抗体的制备方法及其应用，其特征在于，步骤如下：

一、刺激隐核虫传代；

二、斜带石斑鱼的暂养；

三、刺激隐核虫总RNA的提取；

四、一链cDNA的合成：

1)按以下体系添加试剂：Total RNA，1μg；DNase I buffer，1μl；DNase I，1μl；最后加RNase free water至10μl，混匀，短暂离心，37℃恒温孵育30min，以去除基因组DNA污染；

2)反应结束后向上述体系中加入1μl 25mM的EDTA，振荡混匀后，65℃恒温孵育10min，以灭活DNase I；

3)将反应产物迅速转移至冰上冷却；

4)cDNA合成：反应试剂配制体系如下：第一步变性的RNA溶液，11μl；10pmol/μl的Oligo(dT)₂₀，1μl；5×RT Buffer，4μl；dNTP Mixture(各10mM)，2μl；10U/μl的RNase Inhibitor，1μl；ReverTra Ace，1μl；Total Volume 20μl；反应程序：42℃，30min；99℃，5min；4℃，5min；反应产物转到-20℃保存备用。

五、表面蛋白C1基因开放阅读框(ORF)的克隆：

结合刺激隐核虫转录组数据的全长序列，分别设计了用于扩增刺激隐核虫表面蛋白C1基因ORF的引物(5’到3’)：C1 F，ATGTAAAAGATTTTAGCTATTTTATT；C1 R，TCATTTGAATAAAAGAGCAAAG；

模板使用刺激隐核虫一链cDNA，引物使用C1 F/R，PCR反应体系如下：一链cDNA，2μl；10μM的C1 F，2μl；10μM的C1 R，2μl；PrimeSTAR MAX mix，25μl；加H₂O至50μl；PCR反应程序为：98℃，10s；58℃，15s；72℃，2min，35个循环，最后72℃延伸10min；用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物；

回收目的条带，产物与克隆载体pEASY-Blunt Cloning Vector进行连接，连接反应体系如下：PCR回收产物，4μl；pEASY-Blunt Cloning Vector，1μl；

混匀后，于25℃连接30min后转化感受态细胞，从-80℃取出Trans1-T1感受态细胞50μl置于冰上，待感受态细胞刚化开时加入上述所有连接产物，轻轻混匀后冰浴30min，42℃热激30s，立即置于冰上2min，加入1mL LB液体培养基，37℃，200rpm振荡培养1h，取100μl菌液涂布于含有X-gal、IPTG和卡那霉素的LB平板上，37℃倒置过夜培养；

次日挑取白色单菌落于10μl无菌水中，漩涡混匀；取1μl混合液为模板，进行阳性克隆鉴定；反应体系如下：菌液，1μl；10μM的Primer M13F，1μl；10μM的Primer M13R，1μl；Premix Taq，25μl；加H₂O至50μl；PCR反应条件为：先95℃预变性10min；然后94℃，30s；55℃，30s；72℃，3min，共35个循环；最后72℃延伸10min；电泳鉴定阳性克隆，随机挑取3个阳性克隆保种并测序。

六、四膜虫rDNA表达载体的构建：

1)候选基因的结构特征分析

利用软件对表面蛋白C1基因进行以下分析：预测蛋白序列、限制性酶切位点分析、与四膜虫密码子使用偏好性差异分析、信号肽序列分析和GPI锚定位点分析；

2)表面蛋白C1基因的改造

以目的基因eDNA为模板通过PCR对候选基因进行如下改造：在两端设计特异性酶切位点BamH和XhoI、去除GPI-Anchor结构、增加标签、设计TEV位点；

3)候选基因与穿梭载体的连接

把改造后的候选基因和分泌型穿梭载体pTIEV4进行双酶切，酶切位点为BamH和XhoI，连接转化大肠杆菌感受态细胞，挑选阳性克隆测序鉴定；

4)表达载体的构建

把上述穿梭载体和pD5H8载体进行单酶切，酶切位点为NotI，连接转化大肠杆菌感受态细胞，挑选阳性克隆测序鉴定，成功构建四膜虫rDNA表达载体。

七、四膜虫rDNA表达载体的转化和阳性虫株筛选：

1)四膜虫的准备

用NEFF培养基分别培养两种交配型的四膜虫，当细胞浓度达到10⁵个/ml以上时转入饥饿液中震荡培养7-14小时，然后静置培养9.5h，如果镜检发现细胞配对比率达到80％以上，且在荧光显微镜下观察发现新的大核原基已经形成，就可以进行转化；

2)转化

将浓缩的表达载体(浓度＞1μg/μl)包被金颗粒，利用BIO-RAD PDS-1000台式基因枪把表达载体转入四膜虫的大核原基中；

3)筛选

将转化后的细胞培养在NEFF培养基中，依次加入1000×～100×的巴龙霉素进行梯度筛选，最终获得带有9000-10000个外源基因的工程四膜虫。

八、工程四膜虫的诱导表达和重组蛋白的分离纯化：

1)当细胞浓度达到10⁵个/ml以上时800×g离心2分钟弃上清，加入1mM CdCl₂，诱导四膜虫表达；

2)对于分泌型表达的工程四膜虫，诱导3小时后，收集虫液800×g离心2分钟，取上清经硫酸铵沉淀、透析和Ni-NTA树脂纯化后即可得到纯的重组蛋白；

九、重组蛋白多克隆抗体制备：

对新西兰兔进行四次免疫，每次间隔2周，首免疫苗含抗原蛋白500mg，与弗氏完全佐剂1∶1混匀乳化后进行背部多点注射，加强免疫抗原蛋白量减半，与弗氏不完全佐剂混匀乳化后进行背部多点注射，最后一次加强免疫7天后，对免疫新西兰雄兔进行颈动脉采血室温静置2h，4℃过夜，4℃、4000r/min离心30min，后小心吸取上层血清，56℃处理30min以灭活补体，用protein A柱子进行纯化，分装后-20℃保存。

十、ELISA测定多抗效价；

十一、Western blotting检测多抗的特异性；

(1)刺激隐核虫总蛋白提取

1)在液氮中研磨刺激隐核虫幼虫，直至成为匀浆状态；

2)加入蛋白裂解液，冰浴30-45min；

3)用超声波破碎仪对样品进行超声破碎，15s，间隔15s，重复两次；

4)4℃，14000g离心10-20min。取上清，分装后保存于-80℃；

(2)多抗的特异性检测

1)抗原蛋白进行SDS-PAGE电泳，完成后，将凝胶按照蛋白泳道切成适当大小，置于转膜缓冲液进行浸泡；

2)按照蛋白凝胶大小剪裁1张硝酸纤维素膜以及2张转膜专用滤纸，置于转膜缓冲液中进行浸泡；

3)按照棉花垫、滤纸、蛋白凝胶、NC膜、滤纸、棉花垫的顺序铺设“三明治”转膜结构，除去气泡；凝胶向着负极，NC膜向着正极，用夹子加紧；

4)将夹子放入转印槽中，加入转膜缓冲液，80mA恒流转印1h；

5)转印结束后，取出NC膜，放入10％脱脂奶粉封闭液中，4℃封闭过夜或室温封闭1h；蛋白凝胶染色；

6)封闭结束后，弃去封闭液，用TBST洗涤3次，每次5min；

7)加入稀释后的一抗，室温孵育1h；

8)弃去一抗稀释液，TBST洗涤3次，每次5min；

9)加入稀释后的二抗，室温孵育1h；

10)弃去二抗稀释液，洗涤3次，每次5min；

11)加入化学发光显色试剂盒A液和B液各1mL，室温2min，使用化学发光仪进行曝光及拍照。