[发明专利]制备神经干细胞的方法

权利要求书

1.一种制备神经干细胞的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

1、在无菌条件取得神经组织放入神经组织保存液中，并在4～129℃的温度条件下密封保存；

2、将步骤 l中的神经组织从神经组织保存液中取出，并使用神经组织洗涤液漂洗；

3、将步骤 2中漂洗后的神经组织切成碎块，并加入2-3倍体积的神经组织分解液，同时放入35～40℃的二氧化碳培养箱中消化分解45～60分钟，每隔3～5分钟取出震荡一次；

4、向步骤 3中消化分解后的液体中加入继代细胞培养液，均匀混合后，混合液通过200目的细胞筛，收集过滤液，并使过滤液在1500转／分钟的条件下离心8分钟，其中，继代细胞培养液是神经组织分解液体积的2倍；

5、离心后的过滤液去掉上清液，加入原代细胞培养液，使溶液中的细胞浓度为2×105个／毫升，并保持溶液中细胞悬浮培养，培养后即得到PO代神经干细胞。

2.根据权利要求1所述的制备神经干细胞的方法，其特征在于，利用步骤 5中培养得到的PO代神经干细胞继续传代培养的方法包括以下步骤：

(1) Pl代神经干细胞的悬浮培养：①继续培养PO代神经干细胞，当PO代神经干细胞聚集成球后，将其在1500转／分钟的条件下离心8分钟；②离心后的培养液去掉上清液，加入继代细胞培养液，并使培养液中的细胞浓度为l×105个／毫升，接种培养后即得到Pl代神经干细胞；

(2) P2代神经干细胞的贴壁培养：继续培养Pl代神经干细胞，当Pl代神经干细胞密度达到80%时，将继代细胞培养液倒出，加入细胞洗涤液，震荡洗涤后将细胞洗涤液倒出，重复洗涤2次后，加入细胞消化液，同时放入35～40℃的二氧化碳培养箱中消化30秒后取出，加入继代细胞培养液贴壁传代培养后即得到P2代神经干细胞；

(3) P3代神经干细胞的贴壁培养：①继续培养P2代神经干细胞，P2代神经干细胞密度达到80%时，将继代细胞培养液倒出，加入细胞洗涤液，震荡洗涤后将细胞洗涤液倒出，重复洗涤2次后，加入细胞消化液，同时放入35～40℃的二氧化碳培养箱中消化30秒后取出，加入继代细胞培养液并使细胞悬浮，将培养液在1500转／分钟的条件下离心8分钟，去掉上浦液，再次将培养液在1500转／分钟的条件下离心8分钟，去掉上清液，加入细胞冻存液，使培养液中的细胞浓度为1×l05～3×10 5个／毫升，并将培养液在-80℃的温度条件下冻存；②取出冻存的P2代神经干细胞培养液，放入至37～42℃水浴锅中快速震荡使其融化，加入继代细胞培养液贴壁培养后即得到P3代神经干细胞。