[发明专利]一种基于格氏嗜盐碱杆菌Argonaute靶向激活基因转录的方法

说明书

本发明公开了一种NgAGO‑VP64融合蛋白和导向DNA（gDNA），以及一种基于格氏嗜盐碱杆菌Argonaute(NgAGO)靶向激活内源基因转录的方法。所述NgAGO‑VP64融合蛋白的序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。所述导向DNA为SEQ ID NO.3～12所示序列片段中的任一种或几种的混合物。利用所述NgAGO‑VP64融合蛋白和导向DNA与转染试剂共转染细胞，可靶向激活内源基因转录。本发明证明了NgAGO具有结合导向DNA，并具有识别靶点基因组DNA的能力。首次发现NgAGO与VP64构建成的融合蛋白在细胞内具有激活内源基因的能力。本发明解决了近期大家对NgAGO应用的怀疑观望问题，并为后期开发为靶向基因组编辑工具和其它工具提供了支撑。

技术领域

本发明属于生物技术领域。更具体地，涉及一种基于格氏嗜盐碱杆菌Argonaute(NgAGO)靶向激活基因转录的方法。

背景技术

基因编辑技术指能够让人类对目标基因进行“编辑”，实现对特定DNA片段的敲除、加入等。在基础研究、基因治疗和遗传改良等方面展示出了巨大的潜力。因此，基因组编辑工具具有极大的理论和临床应用价值。

目前，基于ZFN和CAS9基因编辑工具的针对艾滋病和肿瘤的治疗新手段已经进入临床实验。并且，初期临床实验结果证明了其有效性。相对于ZFN的基于蛋白与DNA识别的基因组编辑工具，CAS9作为基于RNA与DNA碱基配对识别机制，具有易于操作、利于大批量构建等优点。但由于CAS9需要RNA具有特定二级结构并且识别DNA位点必须具有PAM结构，因此对识别位点具有一定选择性，在一定程度上限制了其应用的范围。

另外，基于DNA与DNA识别的、无二级结构需求的格氏嗜盐碱杆菌(Natronobacterium gregoryi)Argonaute(NgAGO)基因组编辑工具，具有更加广泛的应用前景。但是，目前对于NgAGO的基因组编辑功能，大家仍持有怀疑态度，因为国内国际上的众多科学家都无法重复这个发现。鉴于基于NgAGO的基因组编辑工具具有更加广泛的潜在应用前景，国内国际上众多科学家都试图开发这款工具，但都以失败告终。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有NgAGO基因组编辑工具技术和应用的缺陷及不足，我们的研究发现，格氏嗜盐碱杆菌(Natronobacterium gregoryi)Argonaute(NgAGO)具有结合导向DNA的能力，并具有识别靶点DNA的能力，但缺乏DNA切割能力。因此，本发明将NgAGO与VP64构建成融合蛋白，该蛋白在细胞内具有激活内源基因的能力。本发明解决了近期大家对NgAGO应用的问题，并为后期开发为靶向基因组编辑工具和其它工具提供了支撑。

本发明的目的是提供一种NgAGO-VP64融合蛋白及其在基因编辑或在制备NgAGO基因组编辑工具方面的应用。

本发明另一目的是提供一种基于格氏嗜盐碱杆菌Argonaute(NgAGO)靶向激活基因转录的方法。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

一种NgAGO-VP64融合蛋白，是由VP64与NgAGO融合表达获得。具体是将VP64融合到NgAGO的C末端(记为NgC)或N末端(记为NgN)，并进行人源化密码子优化所得。

所述融合蛋白的序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。

基于所述NgAGO-VP64融合蛋白的结构进行的类似蛋白序列改变且具有相同功能的蛋白，也应在本发明范围之内。

一种表达NgAGO-VP64融合蛋白的质粒，是将NgAGO-VP64融合蛋白基因克隆到表达载体获得。

所述表达载体包括，但不局限于瞬时表达载体、病毒载体，真核表达载体和原核表达载体，具体如表达载体pCDNA3.1。