[发明专利]一种基于96孔板的高通量糖基化肽段除盐富集方法

说明书

本发明属于蛋白质糖基化修饰领域，涉及一种利用96孔板对肽段进行高通量除盐和糖基化富集的新方法，其包括：通过离心，样品的肽段溶液在填装C18材料的96孔脱盐板上实现溶液的脱盐和有机相转换，洗脱的高有机相溶液即为ZIC‑HILIC材料的上样溶液，直接进入装填ZIC‑HILIC填料的96孔板中进行富集，富集的洗脱液可以浓缩或者直接进入质谱分析。本发明在富集的过程中，无需浓缩和溶液相转化，减少样品损失。在保持了传统的基于移液枪头的亲水相互作用小柱富集方法高特异性的同时，实现了大规模样本的快速富集，节省了样品处理时间。

技术领域

本发明属蛋白质分析领域，涉及一种高通量的糖基化肽段富集的方法，具体涉及通过96孔板，用C18材料，ZIC-HILIC两性离子亲水相互作用材料对肽段进行除盐和糖基化肽富集的高通量一体化的新方法。

背景技术

蛋白质的糖基化是一种常见的蛋白质后修饰。研究显示，糖基化修饰在多种生命活动中起十分重要的作用，如，糖基化修饰在蛋白质的折叠，分子识别，细胞间通讯，信号转导以及肿瘤的发生发展等过程中有十分重要的作用。然而，糖基化蛋白的含量很低，且糖蛋白种类繁杂，糖链呈现微观不均一的特点，目前尚缺乏很好的抗体，因此糖基化蛋白高效的富集对后续的分析显得尤为重要。目前，两性离子亲水相互作用色谱ZIC-HILIC材料是应用最广泛的富集方法之一，该方法操作简单，对带不同糖链的肽段都具有很好的富集效果，富集后的糖肽保留了糖链结构，可以用作位点分析，糖链解析，完整糖肽解析等。但是对于大规模的样品，无论是基于色谱还是基于枪头的ZIC-HILIC富集，都将耗费大量时间和人力；此外，基于移液器枪头的ZIC-HILIC富集，在大规模的样本富集中，很难控制每次的洗脱残留体积，因而很难保持富集效率的重现性；同时，富集起始需要溶液低盐且高乙腈浓度，往往需要在富集前对肽段样品进行除盐和冻干，冻干过程除了耗时外，还会带来的样品损失。

基于现有技术的现状，本申请的发明人拟提供一种新的高通量的糖基化肽段富集的方法，尤其是利用96孔板整合C18材料和ZIC-HILIC材料对肽段进行高通量糖基化肽段富集的方法，该方法可实现大规模样品的同时富集避免了冻干和转移过程带来的样品损失，同时通过96孔板的离心平行控制富集过程中溶液的残留，实现高通量、高特异性和高重现性的糖基化肽段富集方法，从而进一步促进糖蛋白的研究。

发明内容

本发明的目的在于克服现有ZIC-HILIC糖肽富集材料和富集手段存在的不足和缺陷，提供一种操作简单、快速高效、高通量高重现的糖基化肽段富集方法，具体涉及一种基于96孔板的高通量糖基化肽段除盐富集方法，尤其涉及一种利用96孔板整合C18材料和ZIC-HILIC材料对肽段进行高通量糖基化肽段富集的方法。

为了实现上述方案，本发明采用如下的技术方案：

1. 将C18材料和ZIC-HILIC材料分别填入带滤膜的96孔板；

2.在装填C18材料的96孔板中，利用C18材料结合胰酶酶解肽段，对样品进行除盐；

3.将C18除盐的洗脱液直接离心，进入装填ZIC-HILIC材料的96孔板相应孔道中，利用两性离子亲水相互作用使活化好的ZIC-HILIC材料结合并富集酶解溶液中的糖基化肽段；

4.将糖基化肽段洗脱下来并进行进行质谱分析；

具体的，本发明的一种基于96孔板的高通量糖基化肽段除盐富集方法，通过C18、ZIC-HILIC材料和96孔板的组合，对样品中的糖基化肽段进行一步到位完成除盐和高特异性富集操作，并进行质谱分析。