[发明专利]一种基于96孔板的高通量糖基化肽段除盐富集方法

权利要求书

1.一种基于96孔板的高通量糖基化肽段除盐富集方法，其特征在于，其包括， 将C18材料和ZIC-HILIC材料分别填入带滤膜的96孔板；在装填C18材料的96孔板中，利用C18材料结合胰酶酶解肽段，对样品进行除盐；将C18除盐的洗脱液直接离心，进入装填ZIC-HILIC材料的96孔板相应孔道中，利用两性离子亲水相互作用使活化的ZIC-HILIC材料结合并富集酶解溶液中的糖基化肽段；将糖基化肽段洗脱并进行质谱分析；包括步骤：

（1）将C18，ZIC-HILIC材料分别填到孔底部带滤膜的96孔板中，滤膜规格为5μm；

（2）在C18 脱盐板中，每孔加入活化液，离心弃去所有溶液,使得C18材料活化；所述活化液为100% 乙腈，所述的离心的条件为15~25℃，100 g~1000 g，

（3）在C18 脱盐板中，每孔加平衡溶液，离心弃去所有溶液使得C18材料平衡；所述的平衡溶液为0.1% 三氟乙酸，所述的离心的条件为15~25℃，100 g~1000 g；

（4）每孔加入相应的样品，肽段和C18材料结合，离心弃去溶液；肽段的浓度为500ng/μL~ 5 μg/μL，肽段样品和材料的质量比为1:15~1:50；所述的离心的条件为15~25℃，100 g~1000 g；

（5）每孔加入平衡溶液，离心弃去溶液；所述的的平衡溶液为0.1% 三氟乙酸，所述的离心的条件为15~25℃，100 g~1000 g；

（6）在ZIC-HILIC富集板中每孔加入洗脱溶液，离心弃去使ZIC-HILIC材料活化；所述得洗脱溶液为75%~80%乙腈，1%三氟乙酸；每次加入体积200 μL~300 μL，所述的离心的条件为15~25℃，100 g~1000 g；

（7）在C18脱盐板中每孔加入洗脱溶液，并将C18脱盐板，ZIC-HILIC富集板和普通96孔板叠在一起，进行离心，使C18材料的洗脱液与ZIC-HILIC材料接触后离去；肽段从C18脱盐板中被洗脱下，进入ZIC-HILIC富集板，ZIC-HILIC材料抓取溶液中的糖肽，其他非糖肽则被离去；所述的洗脱溶液为75%~80%乙腈，1%三氟乙酸；每次加入体积200 μL~300 μL，所述的离心的条件为15~25℃，100 g~1000 g；

（8）ZIC-HILIC富集板中每孔加入洗脱溶液，离心弃去，洗去非糖肽；所述得洗脱溶液为75%~80%乙腈，1%三氟乙酸；每次加入体积200 μL~300 μL，所述的离心条件为15~25℃，1000g~2500 g；

（9）ZIC-HILIC富集板中每孔加入平衡溶液 ，离心并收集溶液，洗脱下来的即为富集的糖肽，冷冻干燥作后续质谱分析；所述的平衡溶液为0.1% 三氟乙酸，所述的离心条件为15~25℃，1000 g~2500 g。

2.按权利要求1所述的方法，其特征是，所述步骤（1）中，每孔填料质量为20 ~100 mg，每孔所对应的肽段起始量为20 μg~5 mg。

3.按权利要求1所述的方法，其特征是，所述步骤（2）中活化液每次加入体积200 μL~300 μL，重复1~2次。

4.按权利要求1所述的方法，其特征是，所述步骤（3），（5），（9）中的平衡溶液，每次加入200 μL~300 μL，重复1~2次。

5.按权利要求1所述的方法，其特征是，所述步骤步骤（6），（7）中离心重复1~2次，步骤(8)中洗涤重复3~6次。