[发明专利]产茶叶碱和咖啡碱的重组基因工程菌及其构建方法和应用

说明书

本发明属于基因工程技术领域，公开了一种新的产茶叶碱和咖啡碱的重组基因工程菌及其构建方法和应用，本发明主要利用以黄嘌呤为甲基受体的咖啡碱合成代谢途径，将茶树咖啡碱合成酶基因TCS1和酵母鸟嘌呤脱氨酶基因GUD1共同导入大肠杆菌中，构建获得一种能在体外发酵生产茶叶碱和咖啡碱的重组大肠杆菌工程菌。该工程菌能在不添加任何底物的条件下，同时高产茶叶碱和咖啡碱，产量分别达到4.17mg/L和20.3mg/L，且产物在发酵液中，易分离纯化，具有良好的工业应用前景。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体地说，涉及一种产茶叶碱和咖啡碱的重组基因工程菌及其构建方法和应用。

背景技术

甲基黄嘌呤属于嘌呤生物碱类，是黄嘌呤甲基化后的衍生物，根据其甲基化位置及数量的不同，可分为1-甲基黄嘌呤、3-甲基黄嘌呤、7-甲基黄嘌呤、3，7-二甲基黄嘌呤(可可碱)、1，3-二甲基黄嘌呤(茶叶碱)、1，7-二甲基黄嘌呤和1，3，7-三甲基黄嘌呤(咖啡碱)。自然界中大约有13个目100多种植物中均含有甲基黄嘌呤类化合物。其中咖啡碱是存在于植物中的天然生物碱，也是茶叶中嘌呤碱的主体成份，对人体具有多种生理作用。适量摄入咖啡碱可以帮助人体适当地升高血压，增加血液中的儿茶酚胺的含量，增强血液中高血压蛋白原酶的活力，提高血清中游离脂肪酸的水平，利尿和增加胃酸的分泌等。茶叶碱作为茶叶中的特征性嘌呤生物碱，具有与咖啡碱相似的利尿、兴奋神经等生理功能。此外，茶叶碱具有极强的舒张支气管平滑肌的作用，有很好的平喘作用，可被用于支气管喘息和抗灸的治疗。

咖啡碱和茶叶碱作为重要的食品添加剂和药用原料，其主要来源于化学合成，存在附产物多且污染环境的弊端。而来源于茶叶或咖啡中天然提取的咖啡碱，则存在原料和加工成本高，易产生有害物残留等弊端。因此，利用基因重组技术，构建重组工程菌，通过微生物发酵生产咖啡碱的方法具有良好的工业应用前景。

目前国内外尚未发现有利用重组大肠杆菌发酵法无底物生产咖啡碱的相关报道。

发明内容

本发明的目的是针对目前市场上合成制备咖啡碱和茶叶碱存在成本高、污染环境、提取率低等缺点，提供一种利用大肠杆菌实现无底物发酵生产咖啡碱和茶叶碱的新方法。

本发明构思如下：利用以黄嘌呤为甲基受体的咖啡碱合成代谢途径来生产咖啡碱，通过将茶树咖啡碱合成酶基因在大肠杆菌中过量表达。同时，为了进一步提高咖啡碱和茶叶碱的产量，高表达了酵母鸟嘌呤脱氨酶基因，以提高前体物质黄嘌呤的供应量。利用构建的产茶叶碱和咖啡碱的重组基因工程菌，可以在不添加任何底物和碳源的LB培养基中，直接发酵生产咖啡碱和茶叶碱。

为了实现本发明目的，本发明首先提供一种重组表达载体，其含有至少1个茶树咖啡碱合成酶基因TCS1表达盒以及至少1个酵母鸟嘌呤脱氨酶基因GUD1表达盒。其中，所述表达盒中的启动子选自Tac、Trp、Tac、IPL或T7启动子，所述重组表达载体选自pET系列、pGEX系列、pMAL系列或pRSF系列。

优选地，所述重组表达载体的出发载体为pRSF-Duet-1。

本发明还提供一种产茶叶碱和咖啡碱的重组基因工程菌，其是将茶树咖啡碱合成酶基因TCS1和酵母鸟嘌呤脱氨酶基因GUD1共同导入工程菌中表达而成的重组基因工程菌。其中，所述工程菌为大肠杆菌工程菌，可选择的表达菌株包括Rosetta(DE3)、BL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS等，优选BL21(DE3)。

所述的重组基因工程菌是将上述重组表达载体导入工程菌中表达而成。

所述的重组基因工程菌可按照如下方法构建获得，将茶树咖啡碱合成酶基因TCS1和酵母鸟嘌呤脱氨酶基因GUD1分别构建到不同表达载体上，然后将含有基因TCS1的表达载体以及含有基因GUD1的表达载体共同导入工程菌中表达而成；或者，将上述重组表达载体导入工程菌中表达而成。