[发明专利]产茶叶碱和咖啡碱的重组基因工程菌及其构建方法和应用在审
| 申请号： | 201710485003.2 | 申请日： | 2017-06-22 |
| 公开（公告）号： | CN107164400A | 公开（公告）日： | 2017-09-15 |
| 发明（设计）人： | 张正竹;李萌萌;邓威威;孙莹;潘思安 | 申请（专利权）人： | 安徽农业大学 |
| 主分类号： | C12N15/70 | 分类号： | C12N15/70;C12N1/21;C12P17/18;C12R1/19 |
| 代理公司： | 北京市京大律师事务所11321 | 代理人： | 王凝,李洪群 |
| 地址： | 230036 安徽*** | 国省代码： | 安徽;34 |
| 权利要求书： | 查看更多 | 说明书： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 茶叶 咖啡碱 重组 基因工程 及其 构建 方法 应用 | ||
1.产茶叶碱和咖啡碱的重组基因工程菌，其特征在于，其是将茶树咖啡碱合成酶基因TCS1和酵母鸟嘌呤脱氨酶基因GUD1串联构建到同一个表达载体pRSF-Duet-1上，其中基因TCS1和基因GUD1分别受两个独立的T7启动子控制，得到重组表达载体pRSF-GUD1-TCS1，然后将该重组表达载体导入大肠杆菌BL21(DE3)中构建而成；
其中，基因TCS1来源于茶树(Camellia sinensis)，基因GUD1来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，它们的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1和2所示。
2.权利要求1所述重组基因工程菌在发酵生产茶叶碱和咖啡碱中的应用。
3.利用产茶叶碱和咖啡碱的重组大肠杆菌工程菌发酵生产茶叶碱和咖啡碱的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、重组大肠杆菌工程菌BL21/pRSF-GUD1-TCS1的构建：将茶树咖啡碱合成酶基因TCS1和酵母鸟嘌呤脱氨酶基因GUD1串联构建到同一个表达载体pRSF-Duet-1上，其中基因TCS1和基因GUD1分别受两个独立的T7启动子控制，得到重组表达载体pRSF-GUD1-TCS1，然后将该重组表达载体导入大肠杆菌BL21(DE3)中构建而成；
其中，基因TCS1来源于茶树(Camellia sinensis)，基因GUD1来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，它们的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1和2所示；
S2、菌株BL21/pRSF-GUD1-TCS1依次经初步培养、扩大培养和诱导表达，最终得到含有茶叶碱和咖啡碱的发酵产物。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤S2具体如下：
S21、初步培养：挑取菌株BL21/pRSF-GUD1-TCS1单菌落于3mL液体LB培养基中，37℃、200rpm条件下振荡培养过夜，得到种子液；
S22、扩大培养：将上述种子液以2％的接种量转入新鲜的LB液体培养基中进行扩大培养，装液量为40mL/150mL，继续在37℃、200rpm条件下振荡培养2-3h，至菌液OD600为0.6-0.8；
S23、诱导表达：向步骤S22所得菌液中加入终浓度为1mM的IPTG，在16℃、110rpm条件下振荡培养20h诱导目的蛋白的表达；
S24、发酵生产咖啡碱和茶叶碱：继续将步骤S23所得菌液在30℃、200rpm条件下振荡培养120h，发酵结束后，收集菌液或离心收集上清，检测其中咖啡碱和茶叶碱的含量。
该专利技术资料仅供研究查看技术是否侵权等信息，商用须获得专利权人授权。该专利全部权利属于安徽农业大学，未经安徽农业大学许可，擅自商用是侵权行为。如果您想购买此专利、获得商业授权和技术合作，请联系【客服】
本文链接：http://www.vipzhuanli.com/pat/books/201710485003.2/1.html，转载请声明来源钻瓜专利网。
