[发明专利]一种用于体外皮肤刺激性检测的重组表皮模型的构建方法

说明书

本发明实施例提供一种用于体外皮肤刺激性检测的重组表皮模型的构建方法，涉及组织工程技术领域，该方法操作简便，工艺稳定，便于规模化生产，产品脂质组成类似于天然人体皮肤，屏障功能完整，方便用于检测化妆品刺激性。该方法包括：步骤一、表皮干细胞分离和大规模培养；步骤二、组织工程表皮构建。

技术领域

本发明涉及组织工程技术领域，尤其涉及一种用于体外皮肤刺激性检测的重组表皮模型的构建方法。

背景技术

化妆品通常和人体皮肤直接接触，其安全性问题备受关注，因此进行皮肤刺激性试验十分必要。传统皮肤刺激试验多采用动物进行，所消耗动物批量大、耗时长、成本高，而且存在种属差异等缺点，某些实验还会给动物造成极大的痛苦，不符合动物保护和福利的要求。随着“3R”原则的提出，国外首先开始在此基础上大力开展动物实验替代方法的研究。经过近20年的皮肤刺激试验体外替代方法的研究，采用体外构建的组织工程皮肤进行毒性评价的方法已逐渐被认可，欧洲替代法验证中心(European Center for the ValidationofAlternativeMethods ECVAM)在2007 年5 月发布的“人皮肤模型用于体外皮肤刺激试验的技术标准”指南，以及在2008 年11 月发布的“两项体外皮肤刺激试验验证方法”声明中，均已表明组织工程皮肤可作为体外皮肤刺激试验的替代模型。

目前为止，商业化和即将商业化的组织重建皮肤模型已达30余种，包括只由表皮细胞形成的表皮模型，具有成纤维细胞真皮层和表皮层的全层皮肤模型，以及含有成纤维细胞、表皮细胞和黑色素细胞的黑色素皮肤模型等。但通过OECD认证的可用于体外皮肤刺激试验的表皮模型只有四款，包括Episkin，EpiDerm，SkinEthic和LabCyte。通过验证的表皮模型数量之所以如此少，主要的原因是构建地组织工程表皮的角质层分化不完全，导致模型的屏障功能较弱。

角质层是表皮的最外层，由角质细胞及包围在其周围的脂类基质组成，这些细胞间脂质主要包含神经酰胺、游离脂肪酸和胆固醇。角质层脂质在维持皮肤屏障功能，皮肤含水量、防止水分流失方面起重要作用，并对角质细胞的粘连和脱屑起调节作用。角质层脂质的组成和含量的改变都是表皮屏障功能的影响因素。现有的商业化表皮模型产品虽然在组织结构上与人类皮肤高度相似性，具有典型的基底层，棘层，颗粒层以及角质层结构，但依然存在其他缺陷，Ponec等研究发现，与人类天然皮肤相比，重建表皮模型中神经酰胺的含量降低，同时游离脂肪酸的含量非常低（Ponec M, Boelsma E, Gibbs S, Mommaas M.Characterization of reconstructed skin models. Skin Pharmacol Appl SkinPhysiol. 2002;15（Suppl1）: 4-17.）。脂质组成的差异是造成模型角质层中板层体分泌和脂质板层异常，屏障功能不完善的原因，这些缺陷导致表皮模型对受试物的通透性偏高，从而对体外安全性测试结果的准确性造成影响，对刺激性标准品的判定存在一定的误判，通过在培养液中添加脂质成分（如棕榈酸、油酸、亚油酸、花生四希酸）虽然能在一定程度上改善脂质组成异常状态，但对脂质板层精细结构的改善作用不明显。

发明内容

本发明实施例提供了一种用于体外皮肤刺激性检测的重组表皮模型的构建方法，该方法操作简便，工艺稳定，便于规模化生产，产品脂质组成类似于天然人体皮肤，屏障功能完整，方便用于检测化妆品刺激性。

为达到上述目的，本发明实施例采用如下技术方案：

本发明实施例提供一种用于体外皮肤刺激性检测的重组表皮模型的构建方法，所述方法包括如下几个步骤：

步骤一、表皮干细胞分离和大规模培养