[发明专利]一种用于体外皮肤刺激性检测的重组表皮模型的构建方法

权利要求书

1.一种用于体外皮肤刺激性检测的重组表皮模型的构建方法，其特征在于，所述方法包括如下几个步骤：

步骤一、表皮干细胞分离和大规模培养

步骤二、组织工程表皮构建

（1）表皮干细胞接种：将步骤一中获得的表皮干细胞用胰酶消化液消化，用接种培养液制成密度为1.25×10⁶-2.5×10⁶个/ml的表皮干细胞分散液，取200μl接种于含有聚碳酸酯滤膜的细胞培养小室中，震荡均匀，在37℃，5% CO₂培养箱中孵育20-30min；

接种培养液包括：KC基础液中添加L-谷氨酰胺1.5-2.0mM/L，表皮生长因子1-10μg/L、氢化可的松10-100μg/L、胰岛素2-20mg/L、BPE 25-50mg/L、氯化钙0.06-0.4mM/L；

（2）液下培养：将接种后的细胞培养小室转入表皮模型培养模具中，小室外的培养皿中加入新鲜表皮细胞TU培养液，37℃，5% CO₂培养箱继续培养24-48h；

表皮细胞TU培养液包括：KC基础液中添加L-谷氨酰胺1.5-2.0mM/L，表皮生长因子1-10μg/L、氢化可的松10-100μg/L、胰岛素2-20mg/L、BPE 25-50mg/L、腺嘌呤 10-50mg/L、转铁蛋白5-12μg/L、氯化钙0.06-0.4mM/L；

（3）气液面培养：吸去细胞小室中的剩余培养基，小室外添加表皮细胞TA培养液进行气液面培养，37℃ 5% CO₂培养箱继续培养8-12天后可得厚度为100-150μm；

表皮细胞TA培养液包括：表皮TU培养液中添加脂质混合物和过氧化物酶体增殖物激活受体激活剂GW501516 0.1-1mM/L、维生素C 30-50μg/L，氯化钙 2.0-3.0mM/L；所述脂质混合物包括：L-丝氨酸0.5-1.0mM/L、棕榈酸8-10μM/L、亚油酸 0.02-0.1mM/L、精氨琥珀酸0.05-0.1 mM/L、牛血清白蛋白0.02-0.1mM/L。

2.根据权利要求1所述的用于体外皮肤刺激性检测的重组表皮模型的构建方法，其特征在于，所述表皮模型培养模具包括：一个用于固定小室的支架和一个配套的培养皿，以保证每个小室与液面接触的高度一致。