[发明专利]一种细胞冻存方法及细胞冻存液

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种细胞冻存方法及细胞冻存液。

背景技术

超低温冷冻保存是细胞长期保存的一种有效方法，主要通过降低细胞的代谢率来起到保护作用。液氮(-196℃)保存细胞是最常见的一种细胞长期保存方式，调节和控制细胞生长代谢的各类酶的作用受到极大抑制，使细胞内部的生化反应十分缓慢，甚至停止，从而避免细胞遗传性状的改变，细胞和组织不会丧失形态发生的潜能。但是，冻伤是超低温保护最大的负反应，其原因是冰晶所致的机械性损伤和渗透性损伤。目前细胞冻存主要是快速冻存法，即玻璃化法。但是如果没有采取合适的冻存方法和合适的冷冻保护剂，细胞在冻存过程中容易被冻伤。改进冻存液和冻存方法是改进保存细胞的重要途径，目前很多研究都是改进冻存液和冻存方法来保护细胞尽量免受冻存过程冻伤的情况。

目前绝大多数冻存液中含有动物源性的血清成分，而动物源性血清存在传染病毒的风险；因动物个体不同，血清产地、批号不同，每批质量差异甚大，其成分不能保持一致，影响每批试验或生产结果；血清成本很高，加重了生产成本。因此，不含血清的细胞冻存液是将来发展的趋势，有些单位或机构研究无血清细胞冻存液。申请号CN201610322202.7的专利公开了一种无血清细胞冻存液，用于解决冻存液使用不方便、成本高、细胞存活率低的问题。申请号CN201610124499.6的专利公开了一种人脂肪干细胞无血清冻存液及其制备方法。

现有无血清的冻存液长期冷冻后解冻，细胞复苏率低，复苏后细胞活性与性能下降，而且无法满足不同细胞长期冻存的需要。

目前大多数冻存液中含有动物源性的血清成分，而动物源性血清存在传染病毒的风险；因动物个体不同，血清产地、批号不同，每批质量差异甚大，其成分不能保持一致，影响每批试验或生产结果；含血清后后期的产品安全检验成本会很高，加重了生产成本。尽管目前玻璃化冻存是比较理想的冻存方法，但是它在玻璃化过程还是会形成冰晶损伤细胞，而且复苏后细胞活率低、细胞增殖数量不足、细胞易老化。

发明内容

本发明实施例提供了一种细胞冻存方法及细胞冻存液，由于该细胞冻存液中不含血清，能够提高细胞复苏率，使细胞复苏后活性与性能高、可满足多种不同细胞长期冻存的需要。

为达到上述目的，本发明实施例采用如下技术方案：

本发明实施例提供一种细胞冻存方法，细胞冻存方法包括以下两个步骤：

步骤一、将混入细胞的细胞冻存液装入容器1，再将容器1装入容器2，其中，容器1和容器2之间形成真空；

步骤二、对步骤一所得的容器2依此执行以下A-D四个步骤：

A、利用常温风冷使容器2的温度从常温下降至4℃，其中，温度下降的速度为每分钟下降3-4℃；

B、利用冰箱使容器2的温度从4℃下降至-20℃，其中，温度下降的速度为每分钟下降1-2℃；

C、利用冰箱使容器2的温度从-20℃下降至-80℃，其中，温度下降的速度为每分钟下降2-3℃；

D、将容器2放入液氮罐中冻存，其中，液氮罐的温度为-196℃。

进一步地，步骤二具体包括：对步骤一所得的容器2依此执行以下A-D四个步骤：

A、利用常温风冷使容器2的温度从常温下降至4℃，其中，温度下降的速度为每分钟下降4℃；

B、利用冰箱使容器2的温度从4℃下降至-20℃，其中，温度下降的速度为每分钟下降1℃；

C、利用冰箱使容器2的温度从-20℃下降至-80℃，其中，温度下降的速度为每分钟下降2℃；

D、将容器2放入液氮罐中冻存，其中，液氮罐的温度为-196℃。

进一步地，细胞为表皮干细胞、成纤维细胞、角膜细胞、脂肪干细胞、黑色素细胞、口腔黏膜上皮细胞或者口腔牙龈细胞。

进一步地，细胞为第2~7代的细胞。

本发明实施例还提供一种细胞冻存液，细胞冻存液应用于如权利要求1-4中任意一项的细胞冻存方法，细胞冻存液包括：DMEM/F12、DMSO、甘油和血清替代物；

其中，DMSO在细胞冻存液中的含量为2-10%的DMEM/F12的体积；甘油在细胞冻存液中的含量为5-30%的DMEM/F12的体积；血清替代物在细胞冻存液中的含量为20-60%的DMEM/F12的体积；

血清替代物包括羟乙基淀粉、葡聚糖、人血白蛋白、重组人转铁蛋白、人AB血清、表皮生长因子、重组人胰岛素、孕酮、氢化可的松、腐胺、硒酸钠和黄酮。