[发明专利]一种细胞冻存方法及细胞冻存液

权利要求书

1.一种细胞冻存方法，其特征在于，所述细胞冻存方法包括以下两个步骤：

步骤一、将混入细胞的细胞冻存液装入容器1，再将所述容器1装入容器2，其中，所述容器1和所述容器2之间形成真空；

步骤二、对步骤一所得的所述容器2依此执行以下A-D四个步骤：

A、利用常温风冷使所述容器2的温度从常温下降至4℃，其中，温度下降的速度为每分钟下降3-4℃；

B、利用冰箱使所述容器2的温度从4℃下降至-20℃，其中，温度下降的速度为每分钟下降1-2℃；

C、利用冰箱使所述容器2的温度从-20℃下降至-80℃，其中，温度下降的速度为每分钟下降2-3℃；

D、将所述容器2放入液氮罐中冻存，其中，所述液氮罐的温度为-196℃。

2.根据权利要求1所述的细胞冻存方法，其特征在于，所述步骤二具体包括：对步骤一所得的所述容器2依此执行以下A-D四个步骤：

A、利用常温风冷使所述容器2的温度从常温下降至4℃，其中，温度下降的速度为每分钟下降4℃；

B、利用冰箱使所述容器2的温度从4℃下降至-20℃，其中，温度下降的速度为每分钟下降1℃；

C、利用冰箱使所述容器2的温度从-20℃下降至-80℃，其中，温度下降的速度为每分钟下降2℃；

D、将所述容器2放入液氮罐中冻存，其中，所述液氮罐的温度为-196℃。

3.根据权利要求1或2所述的细胞冻存方法，其特征在于，所述细胞为表皮干细胞、成纤维细胞、角膜细胞、脂肪干细胞、黑色素细胞、口腔黏膜上皮细胞或者口腔牙龈细胞。

4.根据权利要求3所述的细胞冻存方法，其特征在于，所述细胞为第2~7代的细胞。

5.一种细胞冻存液，其特征在于，所述细胞冻存液应用于如权利要求1-4中任意一项所述的细胞冻存方法，所述细胞冻存液包括：DMEM/F12、DMSO、甘油和血清替代物；

其中，所述DMSO在所述细胞冻存液中的含量为2-10%的所述DMEM/F12的体积；所述甘油在所述细胞冻存液中的含量为5-30%的所述DMEM/F12的体积；所述血清替代物在所述细胞冻存液中的含量为20-60%的所述DMEM/F12的体积；

所述血清替代物包括羟乙基淀粉、葡聚糖、人血白蛋白、重组人转铁蛋白、人AB血清、表皮生长因子、重组人胰岛素、孕酮、氢化可的松、腐胺、硒酸钠和黄酮。

6.根据权利要求5所述的细胞冻存液，其特征在于，所述羟乙基淀粉的浓度为0.1-10%W/V，所述葡聚糖的浓度为0.1-10%W/V，所述人血白蛋白的浓度为0.1-15%W/V，所述重组人转铁蛋白的浓度为1-10%W/V，所述人AB血清的浓度为1-10%W/V，所述表皮生长因子的浓度为0.01-10%W/V，所述重组人胰岛素的浓度为1-10%W/V，所述孕酮的浓度为0.01-5%W/V，所述氢化可的松的浓度为0.01-5%W/V，所述腐胺的浓度为0.01-5%W/V，所述硒酸钠的浓度为0.1-5%W/V，所述黄酮的浓度为0.01-5%W/V。

7.根据权利要求5或6所述的细胞冻存液，其特征在于，所述甘油在所述细胞冻存液中的含量为10-25%的所述DMEM/F12的体积。

8.根据权利要求5或6所述的细胞冻存液，其特征在于，所述血清替代物在所述细胞冻存液中的含量为30-40%的所述DMEM/F12的体积。

9.根据权利要求5或6所述的细胞冻存液，其特征在于，所述DMEM/F12是DMEM培养液和F12培养液以体积比3:1的比例混合的。