[发明专利]一种含黑色素细胞的体外皮肤测试模型的构建方法

说明书

本发明公开了一种含黑色素细胞的体外皮肤测试模型的构建方法，使用人表皮角质形成细胞的培养基作为基础液，分别配置培养基a和培养基b；将角质形成细胞与黑素细胞分别采用培养基a制成细胞悬液，分别接种到均匀接种到Transwell小室中，再加入培养基a在37℃，5%COsubgt;2/subgt;培养箱中进行浸没式培养1~5天，形成含黑色素细胞的表皮层结构；将其置于培养器皿内的培养支架表面，加入培养基b进行气液面培养，置于37℃、5%COsubgt;2/subgt;培养箱中培养5~15天，得到所述含黑色素的皮肤测试模型。该方法模型稳定性高，黑素细胞对外界的刺激更为灵敏，可准确用于化妆品的安全与功效评价的检测，同时原料成本低，制作周期短，稳定性良好，可大量生产。

技术领域

本发明属于组织工程学生物材料技术领域，具体涉及一种含黑色素细胞的体外皮肤测试模型的构建方法。

背景技术

皮肤是最大的人体器官，由外向内大致可分为3层：表皮层、真皮层和皮下组织。表皮层包括角质层和基底层，其中，角质层是皮肤的最外层，能耐受一定的物理、化学、机械性伤害，对内部组织起保护作用。基底层是表皮层的最底层，由基底细胞和黑色素细胞构成。黑素细胞在皮肤细胞中发挥着防御者的作用，黑素细胞通过生成黑素颗粒抵御紫外线以及环境污染对皮肤的伤害作用。

化妆品、药品等产品上市前都要进行大量的测试以保障产品的安全性与功效性。传统的功效性评价是使用动物进行。然而，动物实验本身存在如试验评分主观性强、结果重复性差、动物和人之间的种属差异等弊端均影响对待测样品正确评价。3R理论的提出以及国内外对3R研究的迅速发展，不再以动物模式为基础的评价方法成为的生物医学研究的重要方向。欧盟甚至制定法规来禁止销售采用动物做实验的产品和原料，这对体外检测的研究发展发挥着关键的推动作用。

“一白遮百丑”一直是爱美人士的对皮肤的追求，这使得美白化妆品在化妆品市场占有重要的地位。目前对于美白化妆品的安全以及功效评价是基于动物模型如豚鼠进行验证，但是随着欧盟对动物实验的严令禁止，美白化妆品的安全与功效评价成为的化妆品上市前的一大难题。所以急需开发一种能够评价美白化妆品安全与功效的皮肤模型填补漏洞，并最终完成美白功效性验证。

专利CN101538555A公开了一种采用I型胶原与成纤维细胞制备的真皮层类似物，然后接种角质形成细胞、黑色素细胞，并通过体外培养制备出功能性色素等同物。这种方法所制备的皮肤模型包含真皮层和表皮层。但是这种皮肤模型含有的真皮层中的细胞外基质主要来源于其他动物如牛，而且影响角质形成细胞从培养基中汲取营养成分，导致后期表皮的生发只含有1层或是两层，这与人的表皮结构存在很大差异，并且难应用于长期稳定的检测中。

专利FR2689904和WO95/10600公开了一种含有角质形成细胞和黑素细胞的表皮类似物，但是模型在构建过程中使用的黑素细胞是具有TPA诱导，而TPA是一种致癌性物质，它的存在会影响黑素细胞的生长以及影响后期模型的生发。

专利CN105353114A公开了一种包含成纤维细胞，黑素细胞以及角质形成细胞共建的色素模型。这种构建方法所制备的皮肤模型含有真皮层和表皮层。但是这种皮肤模型的真皮层只含有成纤维细胞，这样不利于成纤维细胞没有影响物质的供给，无法进行伸展以及基质的分泌，最终导致真皮层死亡，而表皮层与培养基之间存在空隙，最终导致表皮层不能接触营养物质导致死亡。

专利CN1493367A公开了一种可调节分泌的组织工程皮肤，此皮肤模型中包含角质形成细胞、成纤维细胞和黑素细胞。但是此制备的模型应用于临床损伤修复，模型过大并且没有形成封闭的空间而不利于化妆品以及药品的检测。

专利CN103983762A公开了一种含有黑素细胞和角质形成细胞的皮肤模型，这种皮肤模型的构建过程中，黑素细胞和角质形成细胞按照一定的比例接种到支架上，但是黑素细胞比角质形成细胞贴壁时间长，导致后期模型形成过程中，黑素细胞不位于表皮的基底层，这与人的皮肤结构存在很大的差异。