[发明专利]一种含黑色素细胞的体外皮肤测试模型的构建方法

权利要求书

1.一种含黑色素细胞的体外皮肤测试模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一：配制培养基

使用人表皮角质形成细胞的培养基作为基础液，分别配置培养基a和培养基b；

培养基a：在基础液中添加对黑色素细胞促进黑色素生成的生长因子，制成基础培养基a；培养基b：以培养基a为基础液，添加促进表皮复层化的氯化钙，制成基础培养基b；

步骤二：表皮层的构建

将角质形成细胞与黑素细胞分别采用培养基a制成细胞悬液，采用分步接种方式将角质形成细胞与黑素细胞分别均匀接种到Transwell小室中，再加入培养基a在37℃，5%CO₂培养箱中进行浸没式培养1~5天，形成含黑色素细胞的表皮层结构；所述分步接种方式为以下任一种：（1）先接种黑色素细胞，再接种角质形成细胞；（2）先接种少量的角质形成细胞，一定时间后接种黑色素细胞，最后再接种角质形成细胞的方式；

步骤三、含黑色素的皮肤测试模型表皮层后期培养

将步骤三中含黑色素细胞的表皮层结构置于培养器皿内的培养支架表面，加入培养基b进行气液面培养，使液面与表皮层结构的表面平齐，置于37℃、5%CO₂培养箱中培养5~15天，得到所述含黑色素的皮肤测试模型。

2.根据权利要求1所述的含黑色素细胞的体外皮肤测试模型的构建方法，其特征在于，所述基础液为KC-Growth细胞培养液。

3.根据权利要求1所述的含黑色素细胞的体外皮肤测试模型的构建方法，其特征在于，所述培养液a为在KC-Growth细胞培养液中添加促细胞生长的因子配制而成，所述促细胞生长因子为：氢化可的松、胰岛素、碱性成纤维细胞生长因子和牛脑垂体提取物。

4.根据权利要求3所述的含黑色素细胞的体外皮肤测试模型的构建方法，其特征在于，配制好的培养液a中各促细胞生长因子的浓度分别为：氢化可的松0.2-0.8μg/mL，胰岛素0.8-1.8μg/mL，碱性成纤维细胞生长因子0.05-0.15ng/mL，牛脑垂体提取物10~100μg/mL。

5.根据权利要求1所述的含黑色素细胞的体外皮肤测试模型的构建方法，其特征在于，配制好的培养液b中氯化钙的浓度为0.47-0.6mmol/L。

6.根据权利要求1所述的含黑色素细胞的体外皮肤测试模型的构建方法，其特征在于，所述步骤二中，表皮层构建前，先使用25μg/mL~75μg/mL的多聚赖氨酸对Transwell培养小室底膜进行过夜包被。

7.根据权利要求1所述的含黑色素细胞的体外皮肤测试模型的构建方法，其特征在于，采用所述分步接种方式（1）时，接种黑色素细胞后先在37℃、5%CO₂培养箱中预培养，待黑素细胞贴壁率达到90%~95%时，再接种角质形成细胞。

8.根据权利要求7所述的含黑色素细胞的体外皮肤测试模型的构建方法，其特征在于，采用所述分步接种方式（1）时，黑色素细胞与角质形成细胞的接种比例为1:1~1:30。

9.根据权利要求1所述的含黑色素细胞的体外皮肤测试模型的构建方法，其特征在于，采用所述分步接种方式（2）时，先将接种的角质形成细胞在37℃、5%CO₂培养箱中预培养0.5小时，再接种黑素细胞，再在37℃、5%CO₂培养箱中预培养，待黑素细胞贴壁率达到90%~95%时，再最后接种角质形成细胞。

10.根据权利要求9所述的含黑色素细胞的体外皮肤测试模型的构建方法，其特征在于，采用所述分步接种方式（2）时，先接种的角质形成细胞与黑素细胞的接种比例为1:10~1:1，黑色素细胞与最后接种的角质形成细胞的接种比例为1:1~1:30。

11.根据权利要求1所述的含黑色素细胞的体外皮肤测试模型的构建方法，其特征在于，步骤2所述黑色素细胞与角质形成细胞接种的细胞总密度为2~10×10⁶个/cm²。