[发明专利]一种永生化兔小肠上皮细胞系及其构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体地说，涉及一种永生化兔小肠上皮细胞系及其构建方法。

背景技术

兔是一种重要的肉制品和皮毛来源，在畜牧生产、餐饮、公共健康等领域都有重要作用。目前，兔的重大疫病如兔瘟、兔球虫、巴氏杆菌病等越来越受到重视。这类病原体多数都侵害消化道。然而，目前的研究中，研究这些疾病的科学工具严重缺乏，制约了相关领域的技术发展。目前兔来源的细胞系较少，因此获得更多兔来源的细胞系将促进兔重大疫病防控的研究。

小肠来源的细胞系是研究各类肠侵袭性病原的可靠细胞学工具，而小肠隐窝来源的带有Lgr5的隐窝干细胞更是研究小肠上皮发育分化的有利工具。因此亟需开发一种可获得隐窝来源的永生化兔小肠上皮细胞系的方法，用以推进兔疫病防控和细胞学方面的研究。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种永生化兔小肠上皮细胞系及其构建方法。

为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：

第一方面，本发明提供一种永生化兔小肠上皮细胞系的构建方法，采集新生兔的小肠，利用含有胶原酶和中性蛋白酶的酶消化液进行消化，消化后使用重悬离心和相差贴壁的方法对细胞进行提纯，获得原代隐窝细胞，进行培养与传代，对获得的细胞转染SV40大T抗原质粒，再连续细胞传代筛选得到永生化兔小肠上皮细胞系。

作为优选，所述酶消化液为含有0.1～0.2mg/mL胶原酶和0.4～0.6mg/mL中性蛋白酶的DMEM培养液。例如，所述酶消化液为含有0.2mg/mL胶原酶和0.5mg/mL中性蛋白酶的DMEM培养液。

进一步地，所述SV40大T抗原质粒包括鸡球蛋白/兔球蛋白混合启动子，SV40大T抗原基因和NEO药筛基因。所述SV40大T抗原质粒的构建方法为：将SV40大T抗原基因(Gene ID 29031019)和NEO药筛基因(NG-047417.1)按顺序插入到pCAGGS载体内。

需要说明的是，目的基因插入质粒的顺序不限于上述顺序。所述pCAGGS载体为市售可得商品，例如可购自BELGIAN CO-ORDINATED COLLECTIONS OF MICRO-ORGANISMS(BCCM)，产品代码为LMBP 2453(http://bccm.belspo.be/catalogues/lmbp-plasmids-plasmid-details？NM＝pCAGGS)。

进一步地，在所述培养与传代的过程中，所述原代隐窝细胞进行初代培养时的培养基为添加10％FBS，20μg/L表皮生长因子，200IU/mL链霉素和青霉素，50μg/mL的庆大霉素，1×Insulin-Transferrin-Selenium(胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂；Gibco，货号1805428)的DMEM培养基。

更为具体地，本发明所述方法包括如下步骤：

(1)细胞分离：在无菌条件下取新生兔的小肠，切碎肠组织，DMEM培养基冲洗肠组织2～3遍，使用上述含有胶原酶和中性蛋白酶的酶消化液在37℃下对肠组织进行消化，消化后使用重悬离心和相差贴壁方法对细胞进行提纯，获得原代隐窝细胞团；

(2)细胞培养：使用添加10％FBS，表皮生长因子20μg/L，200IU/mL链霉素和青霉素，50μg/mL的庆大霉素，1×Insulin-Transferrin-Selenium(胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂)的DMEM培养基，在包被有质量比0.5％明胶(Sigma，货号#SLBN4365V)的培养板上对原代隐窝细胞进行初代培养；

(3)细胞传代：当细胞团块贴壁后生长至90％铺满状态时进行细胞传代，使用PBS洗涤去除培养基后，加入含质量比(m/m)0.02％EDTA的0.25％胰酶消化液进行消化，消化后将细胞重悬传代到新的细胞瓶内，添加适量新细胞培养液；所述含质量比(m/m)0.02％EDTA的0.25％胰酶消化液为市售产品(Macgene，中国；货号G270220)；

(4)细胞转染：当细胞密度到达80％，铺板时间36小时内，使用脂质体(Lipofectamine LTX，Invitrogen公司，货号1657815)转染SV40大T抗原质粒，再连续细胞传代，最终筛选得到永生化兔小肠上皮细胞系。