[发明专利]一种永生化兔小肠上皮细胞系及其构建方法

权利要求书

1.一种永生化兔小肠上皮细胞系的构建方法，其特征在于，采集新生兔的小肠，利用含有胶原酶和中性蛋白酶的酶消化液进行消化，消化后使用重悬离心和相差贴壁的方法对细胞进行提纯，获得原代隐窝细胞，进行培养与传代，对获得的细胞进行脂质体转染表达SV40大T抗原的质粒，再连续细胞传代筛选得到一株永生化兔小肠上皮细胞系。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酶消化液为含有0.1～0.3mg/mL胶原酶和0.4～0.6mg/mL中性蛋白酶的DMEM培养液。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述表达SV40大T抗原质粒包括鸡球蛋白/兔球蛋白混合启动子和SV40大T抗原基因。

4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述原代隐窝细胞进行初代培养时的培养基为添加10％FBS，20μg/L表皮生长因子，200IU/mL链霉素和青霉素，50μg/mL的庆大霉素，1×Insulin-Transferrin-Selenium的DMEM培养基。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)细胞分离：在无菌条件下取新生兔的小肠，切碎肠组织，DMEM培养基冲洗肠组织2～3遍，使用上述含有胶原酶和中性蛋白酶的酶消化液对肠组织在37℃下进行消化，消化后使用重悬离心和相差贴壁方法对细胞进行提纯，获得高纯度原代隐窝细胞团；

(2)细胞培养：使用添加10％FBS，表皮生长因子20μg/L，200IU/mL链霉素和青霉素，50μg/mL的庆大霉素，1×Insulin-Transferrin-Selenium的DMEM培养基，在包被有明胶的培养板上对原代隐窝细胞进行初代培养；

(3)细胞传代：当细胞团块贴壁后生长至90％铺满状态时进行细胞传代，使用PBS洗涤去除培养基后，加入含质量比0.02％EDTA的0.25％胰酶消化液进行消化，消化后将细胞重悬传代到新的细胞瓶内，添加适量新细胞培养液；

(4)细胞转染：当细胞密度到达80％，铺板时间36小时内，使用脂质体转染表达SV40大T抗原质粒，再连续细胞传代筛选得到永生化兔小肠上皮细胞系。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(3)中第1代到第5代使用的细胞培养液为10％FBS，表皮生长因子20μg/L，200IU/mL链霉素和青霉素，50μg/mL的庆大霉素，1×Insulin-Transferrin-Selenium的DMEM培养基；第五代后使用的细胞培养液为7.5％FBS，表皮生长因子20μg/L，200IU/mL链霉素和青霉素，50μg/mL的庆大霉素，1×Insulin-Transferrin-Selenium的DMEM培养基。

7.一种永生化兔小肠上皮细胞系，其特征在于，利用权利要求1～6任一项所述的方法建立得到。

8.根据权利要求7所述的永生化兔小肠上皮细胞系，其特征在于，所述永生化兔小肠上皮细胞系同时表达肠上皮表面标志分子和隐窝基层干细胞的表面分子。

9.根据权利要求8所述的永生化兔小肠上皮细胞系，其特征在于，所述肠上皮表面标志分子包括但不限于角蛋白8，E-降钙素和ki67；所述隐窝基层干细胞的表面分子包括但不限于Lgr5，sox9。

10.权利要求7～9任一项所述的永生化兔小肠上皮细胞系在建立兔小肠上皮体外模型中的应用。