[发明专利]一种用于研究破骨细胞融合的荧光蛋白标记方法

说明书

技术领域

本发明属于医疗技术领域，尤其是一种用于研究破骨细胞融合的荧光蛋白标记方法。

背景技术

在本技术之前，用于观察破骨细胞融合的技术主要有两类：1.借助延时摄影显微镜(Time-lapse micrescope)进行活细胞摄影；2.借助病毒包装原理进行研究。具体如下：

延时摄影技术：即借助延时摄影显微镜每间隔一定时间采集明场中活细胞的图像，借此研究是否发生了破骨细胞的融合。但是明场情况下即便放大倍数很高也无法清晰直观地观察破骨细胞融合过程中细胞形态、细胞核数目等细节，更不能定量分析多少细胞发生了融合。因此无法研究干预因素对破骨细胞融合过程中细胞的形态、细胞核数目、融合的细胞数目等方面的影响。

例如下例已发表的研究，如图7。

在明场环境下只能观察到细胞间类似“相互靠近”的距离变化，而后发生了细胞形态的模糊改变。无法观察到具体的细胞结构、细胞核数目的改变；更无法定量分析此刻有多少细胞发生了融合。

病毒包装原理：即将包装障碍的荧光报道基因标记的病毒质粒和辅助包装质粒分别转染到破骨前体细胞系Raw264.7中，若破骨前体细胞系发生了融合则会产生包装完成（具有感染能力）的成熟的荧光报道基因标记的病毒上清液。将这个上清液加到模式细胞系的培养基中，则模式细胞系被上述病毒感染后可在荧光显微镜下观察到荧光表达。但这个过程是间接地研究破骨细胞融合，完全不能观察到破骨细胞融合过程中细胞形态、细胞核数目等细胞形态学改变。并且也无法直接定量破骨细胞的融合数目。并且过程繁复耗时，病毒包装的技术复杂，所需实验仪器和试剂较多；更严重的是存在病毒感染的生物安全问题，不是每一个实验室都能开展研究（仅限具有病毒研究的生物安全等级较高的研究室）。

实验示意图如图8。

研发过程中遇到的难题：如何能够可视地、清晰地观察到破骨细胞融合的全程。并且在这个过程中还能观察到细胞形态、细胞核数目的改变。更难地是还要能用于定量研究干扰因素对破骨细胞融合效率的影响。

如果能够得到便捷、清晰、直观、可视、便捷的技术去观察破骨细胞融合过程中细胞的形态、细胞核数目等细胞行为的改变；同时最好还能定量研究干预因素对破骨细胞融合效率的影响的方法，是现在的需求和发展趋势。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种用于研究破骨细胞融合的荧光蛋白标记方法，可以直观可视地观察破骨细胞融合过程，从而观察破骨细胞形态、细胞核数目及可以定量研究融合的细胞数目；也可以利用本荧光标记方法直观可视地观察到这些因素对融合过程、融合效率和融合中细胞行为产生了哪些影响，从而为研究破骨细胞融合提供了简便、可靠的工具。

解决以上技术问题的本发明中的一种用于研究破骨细胞融合的荧光蛋白标记方法，其特征在于： 包括以下步骤：

（1）将含CTSK-Cre转基因的小鼠原代骨髓单核细胞（bone marrow monocytes,BMMs）和含Rosa^mTmG的转基因小鼠原代骨髓单核细胞以3:1-1:3的比例混合培养；

（2）进行破骨分化向诱导；

（3）荧光显微镜观察。

所述步骤（1）中混合培养前先Cre重组酶能特异性识别 loxp DNA 序列，使 loxP位点间的基因序列被删除或重组，从而实现条件性基因打靶，混合培养后CTSK-Cre转基因的小鼠原代骨髓单核细胞与Rosa^mTmG的转基因小鼠原代骨髓单核细胞发生融合，最终产生绿色荧光蛋白。

CTSK在骨骼系统中是破骨细胞特异性表达的基因，因此Cre重组酶只在破骨细胞中表达。而Rosa^mTmG转基因小鼠的细胞在无Cre重组酶时细胞膜表达红色荧光蛋白，而在Cre重组酶存在的情况下则通过上述Cre/loxp系统原理剪切掉红色荧光蛋白的基因而启动绿色荧光蛋白基因的表达，此时的细胞膜上表达绿色荧光蛋白。

所述步骤（1）中培养条件为：含10%FBS，1%P/S的DMEM培养基 ，37℃恒温孵箱，5%二氧化碳，95%氧气。

所述培养条件中，混合后细胞总量达到以下要求：A、96孔板细胞总量为3000-8000，培养基体积为100ul；B、其他的孔板或者培养皿应根据其底面积与96孔板的底面积进行比例换算，得到最终的混合细胞量。