[发明专利]一种中国板栗的基因转化方法

权利要求书

1.一种中国板栗的基因转化方法，其特征在于，以中国板栗的体细胞胚作为受体，所述受体与含有pBI121植物表达载体的根癌农杆菌AGL1的转染菌液共培养，经筛选培养得到含有目的基因转化的中国板栗组织；

其中，所述pBI121植物表达载体携带目的基因。

2.根据权利要求1所述的中国板栗的基因转化方法，其特征在于，所述中国板栗的体细胞胚采用盛花期后45～55d的幼胚胚尖诱导而成。

3.根据权利要求2所述的中国板栗的基因转化方法，其特征在于，所述体细胞胚采用以下方法制备：

取中国板栗的幼胚胚尖，消毒灭菌后，接种于诱发培养基，于23-25℃暗培养，每18-25天更换一次诱发培养基，至体细胞胚形成，继续在诱发培养基上培养1～2周，得到作为受体的体细胞胚；

所述诱发培养基的各成分以及各成分的浓度如下：WPM2.3±0.1g/L，Vitamin100±2mg·L^-1，水解酪蛋白1.0±0.1g·L-1，2,4-D0.2mg/L，6-BA0.2mg/L，蔗糖3wt％±0.1wt％，琼脂0.7wt％±0.1wt％。

4.根据权利要求1所述的中国板栗的基因转化方法，其特征在于，共培养时，所述转染菌液中的根癌农杆菌AGL1处于对数生长期。

5.根据权利要求1所述的中国板栗的基因转化方法，其特征在于，所述转染菌液通过以下方法制备：

(a)、所述根癌农杆菌AGL1培养至菌液OD值为0.6～1.0，离心得到菌体；

(b)、所述菌体中加入诱导培养基使菌体悬浮，所述诱导培养基的体积为步骤(a)中菌液的0.2-0.5倍；

(c)、以转速为70-80r/min，温度为21～23℃，培养2～4小时，得到所述转染菌液；

所述诱导培养基的各成分以及各成分的浓度如下：WPM2.3±0.1g/L，MES buffer9.75±0.1g/L，蔗糖10±0.1g/L，pH5.5±0.05，乙酰丁香酮80±1mM。

6.根据权利要求5所述的中国板栗的基因转化方法，其特征在于，所述诱导培养基的体积为步骤(a)中菌液的0.3-0.4倍。

7.根据权利要求5所述的中国板栗的基因转化方法，其特征在于，步骤(a)中的离心的转速为3000-5000r/min，离心的时间为5-15min。

8.根据权利要求6所述的中国板栗的基因转化方法，其特征在于，步骤(a)中的离心的转速为3000-5000r/min，离心的时间为5-15min。

9.根据权利要求5所述的中国板栗的基因转化方法，其特征在于，步骤(a)中根癌农杆菌AGL1的培养采用含有卡那霉素的LB培养基进行。

10.根据权利要求1所述的中国板栗的基因转化方法，其特征在于，所述共培养为：所述转染菌液浸泡所述体细胞胚，温度为23～25℃，浸泡时间为40-80min。

11.根据权利要求10所述的中国板栗的基因转化方法，其特征在于，所述浸泡时间为50-60min。

12.根据权利要求10所述的中国板栗的基因转化方法，其特征在于，所述浸泡在360°旋转器上进行，在浸泡的同时，旋转器以转速为35～40r/min旋转。

13.根据权利要求11所述的中国板栗的基因转化方法，其特征在于，所述浸泡在360°旋转器上进行，在浸泡的同时，旋转器以转速为35～40r/min旋转。

14.根据权利要求1-13任一项所述的中国板栗的基因转化方法，其特征在于，所述筛选培养为：将共培养得到的体细胞胚放置于加有500～600μl无菌水的滤纸上，暗培养40-50h；

然后转移到抑制农杆菌培养基上平铺培养，暗培养6-8d；

加入液体筛选培养基于生物反应器中培养，每3-4小时制动2分钟，暗培养，10-15d换一次培养基，6～8周之后，将筛选出的愈伤组织转移到固体筛选培养基中；

25-30d后，转移到含有抗性筛选的诱发培养基中，暗培养，得到筛选的愈伤组织；

其中，筛选培养过程中的温度均为23～25℃；

所述诱发培养基的成分以及各成分的浓度如下：WPM2.3±0.1g/L，Vitamin100±2mg·L^-1，水解酪蛋白1.0±0.1g·L^-1，2,4-D0.2mg/L，6-BA0.2mg/L，蔗糖3wt％±0.1wt％，琼脂0.7wt％±0.1wt％；

所述抑制农杆菌培养基的成分以及各成分的浓度如下：所述诱发培养基中添加头孢噻肟80±1μg/ml和特美汀600±5μM；

所述液体筛选培养基的成分以及各成分的浓度如下：所述诱发培养基去除琼脂，添加头孢噻肟80±1μg/ml、特美汀300±2μM和筛选抗生素60±1μg/ml；

所述固体筛选培养基的成分以及各成分的浓度如下：所述诱发培养基中添加头孢噻肟80±1μg/ml、特美汀600±2μM和筛选抗生素60±1μg/ml。