[发明专利]一种适用于产孢真菌核型分析的染色体DNA制备方法

说明书

本发明属于生物技术领域，涉及一种适合于产孢真菌核型分析的染色体DNA制备方法，其特征在于：包括分生孢子收集、孢子琼脂糖块制备、原生质体琼脂糖块制备、完整染色体琼脂糖块制备等步骤，操作简单，且能获取高浓度、完整的染色体DNA，能够直接用于真菌核型分析和遗传育种研究。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种适合于产孢真菌核型分析的染色体DNA制备方法。

背景技术

真核生物的染色体承载着遗传信息，控制着生物体的生长、遗传、发育和变异。染色体是由DNA和蛋白质组成，其上的遗传信息以密码子的形式储存在DNA上，研究染色体的组型和行为是至关重要的。由于大多数真菌属于半知菌亚门，缺乏有性世代，细胞核分裂时观察不到染色体凝缩，同时真菌染色体很小，没有足够数目的基因标记，所以很难用核染色和杂交等的方法进核型分析和遗传育种研究，也很难用细胞学方法测定其染色体数目和大小。此外，真菌的染色体数目变化范围相对大，用普通的琼脂糖凝胶电泳（小于50Kb）和聚丙烯酰胺凝胶电泳（5-500Kb）都不能完整的分析。八十年代初发展起来的脉冲电泳（PulsedField Gel Electrophoresis,PFGE）技术解决了这方面的问题，此技术分离的DNA分子量范围较大，能最大分离大于10Mb的DNA。因此，近年来被应用来分离真菌染色体DNA，测定其染色体数目和大小。

用PFGE技术分离染色体DNA时，首先要解决染色体标本的制备，在制备标本时必须让染色体DNA从细胞中释放出来，同时又要保持染色体DNA的完整性。真菌的细胞壁组成成分较为复杂，破壁困难，不能获得高质量的原生质体，最后导致染色体DNA不能从细胞中大量释放出来。目前真菌原生质体制备主要采用酶解法，酶解时一定要选择合适的破壁酶，此外，要掌握好酶解的温度和时间等因素。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种适合于产孢真菌核型分析的染色体DNA制备方法，操作简单，且能获取高浓度、完整的染色体DNA，能够直接用于真菌核型分析和遗传育种研究。

解决以上技术问题的本发明中的一种适用于产孢真菌核型分析的染色体DNA制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）分生孢子收集：将产孢真菌进行液体培养后过滤菌液，得到分生孢子悬浮液，离心，用EDTA溶液洗涤2次，再将孢子悬浮在EDTA溶液中，制成浓度为2×10⁸/ml的分生孢子悬浮液；

（2）孢子琼脂糖块制备：将步骤（1）中分生孢子悬浮液与琼脂糖等体积混合制成孢子琼脂糖块，把孢子琼脂糖块放入3-4℃凝固10-15min；

将分生孢子固定在琼脂糖内，避免后面释放的染色体DNA被打断，保证染色体DNA的完整性,同时制备染色体DNA。

（3）原生质体琼脂糖块制备：将步骤（2）中的孢子琼脂糖块放入酶液中，于36-37℃酶解3-4h，用无菌水洗涤2次；

（4）完整染色体琼脂糖块制备：将步骤（3）中酶解后的琼脂糖块放入NDS缓冲液中，于45-55℃水浴中裂解22-25h，重复1次；最后原生质体的浓度为1×10⁸/ml。

（5）将步骤（4）中的琼脂糖块，用TE缓冲液在48-53℃下洗涤2次，每次0.8-1.4h，然后浸在TE缓冲液中并保存在4℃备用。

所述步骤（1）中EDTA溶液浓度为0.02-0.05 M 。

所述步骤（2）中琼脂糖先预冷至45-50℃，质量浓度1.4%，低熔点（熔点为64-65℃）。

所述步骤（3）中酶液配方为：破壁酶5-10mg/mL， NaCl0.6M， NaH₂PO₄ 8.4 mM，Na₂HPO₄ 1.6 mM，pH5.8。