[发明专利]一种人间充质干细胞外泌体冻干粉的制备方法、使用方法

说明书

本发明提出了一种人间充质干细胞外泌体冻干粉的制备方法、使用方法，用以解决外泌体的分离回收数量少、质量差、效率低的问题，一种人间充质干细胞外泌体冻干粉的制备方法，包括以下步骤：1)人间充质干细胞的培养、纯化及传代；2)诱导人间充质干细胞大量合成和分泌有功能的外泌体；3)超滤浓缩人间充质干细胞外泌体，制得浓缩培养液并进行冷藏；4)将冷藏后的所述浓缩培养液制备成冻干粉，向所述冻干粉中添加复合液进行保存，本发明可以有效地诱导间充质干细胞最大限度的合成和分泌外泌体，有助于大规模地获取这些活性成分，便于直接地用于大健康的方方面面，如疾病的诊治和人体的美容整形。

技术领域

本发明涉及干细胞技术领域，特别是指一种人间充质干细胞外泌体冻干粉的制备方法、使用方法。

背景技术

间充质干细胞是一群中胚层来源的具有多向分化潜能的多能干细胞，大量研究已经证明间充质干细胞存在于几乎所有的组织和器官，如骨髓、肝脏、脾脏、肺肾、胃肠、骨骼肌、外周血、脂肪、韧带、胎盘、脐带、脐血、牙髓和皮肤等组织中。人脐带间充质干细胞是一类来源于新生儿脐带，具有自我更新和多向分化潜能的干细胞，这类细胞与其他来源的间充质干细胞相比，具有来源丰富，易于采集和运输，增殖能力强，本身无异体排斥反应、不涉及伦理问题等诸多优点，近年来逐渐成为倍受人们关注的成体干细胞。目前研究显示，人脐带间充质干细胞可作为多种疾病治疗的细胞来源，修复多种原因引起的组织损伤，激活体内的休眠细胞，更新和替代衰老和死亡的细胞，但是长期移植入体内后，由于增殖分化和异体抗原的出现，或发生不良分化致瘤的缺点，限制了其在临床广泛应用。

近来研究发现间充质干细胞除了上述细胞学的特征外，还能向细胞外分泌一些不同大小的囊泡，如小囊泡(80-1000nm)和外泌体(30-150nm)等。外泌体的分泌最早是由Johnstone等在1987年研究网织红细胞的成熟过程中发现的，在体外培养羊网织红细胞的上清中经过100000g离心90分钟后可以收集到直径60纳米的囊性小泡，小泡中含有网织红细胞成熟过程中放出的胞膜结构，表面富含胆固醇、神经鞘磷脂、神经酰胺等脂类物质。Johnstone将这些纳米级的囊泡命名为外泌体(exosomes)。这种囊泡是一种由真核细胞的多泡内涵体(multivesicularbodies，MVBs)与细胞膜融合后释放到细胞外环境中的纳米量级的膜性小囊泡，可由多种类型细胞分泌，其内含有不同种类的蛋白质(如生长因子，细胞因子、转录因子和酶等)、脂质(胆固醇cholesterol，神经鞘磷脂sphingomyelin，和ceramide等)、RNAs如LincRNA，mRNAs和microRNAs、信号分子等具有生物学活性的物质，较易与邻近细胞的细胞膜发生融合，将生物学活性物质选择性地递送至受体细胞，在不同细胞间进行信息传递，调节细胞间的信号传导，发挥多种生物学功能。研究还发现外泌体除了清除细胞内多余的蛋白质外，还具有更多潜在的生物功能，很多实验证实了外泌体作为信息复合体能够转运胞质并在胞间信号转导中起关键性的作用，这种信号模式与经典的模式不同，外泌体不仅是一个脂质体，还是一个具有多种生物活性的纳米复合体。有文献报道，移植间充质干细胞能够通过旁分泌有效生物学活性物质-外泌体，从而激活细胞的增殖和迁移，抵抗应急氧和自由基的损伤，防止细胞的凋亡，和修复组织的损伤等多种效果。可见，人脐带间充质干细胞来源的外泌体具有多种重要的生理功能，将其开发成为一种既具有间充质干细胞特点而又能克服其缺陷的新型治疗方式，是今后具有重要探讨价值的研发方向。