[发明专利]一种人间充质干细胞外泌体冻干粉的制备方法、使用方法

权利要求书

1.一种人间充质干细胞外泌体冻干粉的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)人间充质干细胞的培养、纯化及传代；

2)诱导人间充质干细胞大量合成和分泌有功能的外泌体；

3)超滤浓缩人间充质干细胞外泌体，制得浓缩培养液并进行冷藏；

4)将冷藏后的所述浓缩培养液制备成冻干粉，向所述冻干粉中添加复合液进行保存；

步骤2)的具体操作方法：选择增殖能力强的第3～5代人间充质干细胞，置于含氧量为21％的37℃培养箱中，用含有5％FBS的DMEM/F12培养基进行培养，直到细胞汇合度为60～70％时，改用促进外泌体合成和分泌的培养条件进行培养3～5天，后收集上清液；

所述促进外泌体合成和分泌的培养条件：无血清的饥饿培养基，同时向所述饥饿培养基中添加促进因子，且所述饥饿培养基中含氧量为1％～5％，pH值为6.5～7；

所述促进因子为：1-100ng/ml伽马干扰素，1-10mg/ml多聚赖氨酸，1-6ng/ml MG-CSF，2-5ng/ml IL-6,1-5ng/ml HGF,1-10mM ATP，14mg/dl钙离子；

所述饥饿培养基包含细胞因子、维生素C、化学小分子，其中各组分的含量如下，

所述饥饿培养基还包括增加了ITS添加剂的DMEM/F12基础培养基，所述ITS为胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠培养基添加剂，所述基础培养基的配制方法：将DMEM和F12按溶液体积比1:1的比例混合均匀后，再添加1％ITS而成；

步骤1)中人间充质干细胞的培养采用无血清培养基，所述无血清培养基包含细胞因子、维生素C、化学小分子，其中各组分的含量如下，

所述无血清培养基还包括增加了ITS添加剂的DMEM/F12基础培养基，所述ITS为胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠培养基添加剂，所述基础培养基的配制方法：将DMEM和F12按溶液体积比1:1的比例混合均匀后，再添加1％ITS而成。

2.如权利要求1所述的一种人间充质干细胞外泌体冻干粉的制备方法，其特征在于，

步骤3)中浓缩方法：采用离心机对步骤2)的产物进行离心，去除细胞碎片以及细菌后，过滤，将滤液进行超滤离心，制得浓缩液，向所述浓缩液中添加赋形剂并置于-80℃进行冷藏。

3.如权利要求2所述的一种人间充质干细胞外泌体冻干粉的制备方法，其特征在于，

所述赋形剂为甘露醇，添加量为每100ml浓缩液中添加甘露醇5g。