[发明专利]利用等离子体诱变灵芝原生质体以构建突变菌株的方法

说明书

本发明公开了一种利用等离子体诱变灵芝原生质体以构建突变菌株的方法，包括如下步骤：(1)灵芝原生质体构建：①灵芝液体培养菌丝体制备；②菌丝体匀浆制备；③细胞壁溶解酶液制备及细胞壁溶解；④原生质体分离及收集；⑤原生质体浓度校正及保存；(2)低温等离子体诱变原生质体：①原生质体诱变前准备；②等离子体诱变装置通气平衡；③反应体系通电，对原生质体进行诱变；④原生质体平板涂布均匀和静置再生培养；⑤诱变菌株挑选；⑥观察记录菌落形态及生长速率，光镜下观察菌丝形态；⑦诱变菌株的活性物质和稳定性检测；⑧保存菌种。本发明的优点在于：提供了一种稳定高效的利用等离子体诱变灵芝原生质体以构建突变菌株的方法。

技术领域

本发明涉及农作物诱变育种技术领域，尤其涉及一种利用等离子体诱变灵芝原生质体以构建突变菌株的方法。

背景技术

灵芝(Ganoderma Lucidum)为担子菌亚门、层菌纲、多孔菌目、非褶菌科、灵芝属的子实体，是比较名贵的传统中草药。其中，灵芝的有效成分如灵芝多糖、三萜等具有抗肿瘤、抗氧化、调节免疫，保肝，调节血糖等作用。

灵芝作为多细胞生物，具有较厚的细胞壁，常规的方法很难达到良好的诱变效果；孢子诱变虽然能够获得单细胞诱变效果，但其采收季节受到限制。原生质体由于人工去除了细胞壁，受辐射后诱变效率较高，且不受采收季节等限制，在实验条件下随时可以进行，是理想的诱变方式。

等离子体被称为除气体、液体、固体以外物质的第四态，不同的激发方式和发生器结构可以产生不同热力学状态的等离子体。低温常压等离子体具有在大气压下放电均匀性高、温度可控在室温范围，操作条件安全、温和，可控性强等特点，适于生物诱变育种，受到了学术界和工业界的广泛关注。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种稳定高效的利用等离子体诱变灵芝原生质体以构建突变菌株的方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：一种利用等离子体诱变灵芝原生质体以构建突变菌株的方法，包括如下步骤：

(1)灵芝原生质体的构建

①灵芝液体培养菌丝体的制备；

②菌丝体匀浆制备；

③细胞壁溶解酶液的制备及细胞壁溶解；

④原生质体的分离及收集；

⑤原生质体浓度校正及保存；

(2)低温等离子体诱变原生质体

①原生质体的诱变前准备；

②等离子体诱变装置通气平衡；

③反应体系通电，对原生质体进行诱变；

④固体培养基中，原生质体平板涂布均匀和静置再生培养；

⑤诱变菌株挑选，用牙签挑选小菌落后，接种于PDA固体培养基上；

⑥观察记录菌落形态及生长速率，光镜下观察菌丝形态；

⑦诱变菌株的活性物质和稳定性检测；

⑧选取诱变后品质优良的菌株固体培养，保存菌种。

作为本发明的优选方式之一，所述步骤(1)中灵芝液体培养菌丝体的制备方法为：在无菌条件下，将固体发酵灵芝种子菌丝体接种于灭菌后的PD液体培养基中，于27-29℃，150-200rpm转速摇床震荡培养，5-7d后，将菌丝体连同菌液取出，超净台中离心后用ddH₂O清洗菌丝体。