[发明专利]Anti AFP CAR-T细胞及其制备方法和应用

说明书

本发明提供一种Anti AFP CAR‑T细胞及其制备方法和应用，所述Anti AFP CAR‑T细胞在T细胞内表达SCFV–IgD–CD28–OX40–CD3ζ融合蛋白；所述SCFV–IgD–CD28–OX40–CD3ζ融合蛋白中，所述SCFV用于结合所述AFP蛋白，并且所述SCFV的氨基酸序列为第一序列。该细胞经过对T细胞修饰和改造得到，并且能够特异性识别和杀伤肝癌，适用于相应肿瘤疾病的预防和治疗。

技术领域

本发明涉及一种Anti AFP CAR-T细胞及其制备方法和应用，属于基因修饰细胞及肿瘤治疗技术领域。

背景技术

原发性肝癌(hepatocellular carcinoma，简称：HCC)居恶性肿瘤发病率的第五位,全球每年死亡人数约100万。目前，大部分原发性肝癌患者缺乏有效的治疗手段,总的生存率仅为3％-5％。肝移植虽已成为治疗原发性肝癌的重要手段，但供体短缺、手术损伤、免疫排斥以及费用高昂等问题构成了肝脏器官移植技术发展的主要障碍。因此，有必要探索一种新的、有效治疗途径。随着分子生物学、基因工程技术及免疫学的飞速发展，以免疫治疗为基础的生物治疗已显示出良好的应用前景。

嵌合抗原受体T细胞(Chimeric antigen receptor T cell，简称：CAR-T cell)是通过基因修饰的手段，使能特异性识别靶抗原的单克隆抗体的单链可变区(single chainFv domain，简称：SCFV)表达在细胞表面，同时通过跨膜区与人工设计的细胞胞内的活化增殖信号域相耦连。表达CAR的T细胞可通过SCFV直接识别并结合肿瘤细胞表面的肿瘤相关抗原，CAR将信号传入T细胞内，激活T细胞分泌细胞因子包括穿孔素、颗粒酶、INF-γ、TNF-α等，从而发挥杀伤肿瘤细胞的作用。因此，CAR-T细胞是主要组织相容性复合体(majorhistocompatibility complex，简称：MHC)非限制性的，其应用的关键是确定一种肿瘤相关抗原，在肿瘤细胞表面高表达，而在正常组织中无表达或者低表达。

甲胎蛋白(alpha-feto protein，简称：AFP)是胎儿时期肝脏内合成的一种糖蛋白,成人后血清中水平很低,发生恶变的肝细胞则又可恢复其合成的能力，其在70％-80％的原发性肝癌(HCC)中有较高的表达水平。研究证实将表达mAFP基因的小鼠肝癌细胞株Hepa1-6接种C57BL/6J小鼠，再用插入AFP基因的质粒DNA免疫小鼠，结果发现这种治疗性的免疫AFP质粒DNA能诱发较强的特异性CTL免疫反应。还有研究应用AFP来源的免疫优势多肽疫苗治疗IV期HCC患者，6例患者中5例显示AFP多肽在体内具有免疫原性,能在血清AFP水平较高的患者中刺激抗原特异性T细胞。因此，AFP作为肝癌细胞的特异性抗原,可作为CAR-T细胞抗肿瘤治疗的一个理想靶点。

发明内容

本发明提供一种Anti AFP CAR-T细胞及其制备方法和应用，该细胞经过T细胞修饰和改造得到，并且能够特异性识别和杀伤AFP高表达的肝癌细胞，适用于相应肿瘤疾病的预防和治疗。

本发明提供一种Anti AFP CAR-T细胞，所述Anti AFP CAR-T细胞在T细胞内表达SCFV–IgD–CD28–OX40–CD3ζ融合蛋白；所述SCFV–IgD–CD28–OX40–CD3ζ融合蛋白中，所述SCFV用于结合所述AFP蛋白，并且所述SCFV的氨基酸序列为第一序列，所述第一序列为：

EVQLVQSGAEVKKPGESLTISCKASGYSFPNYWITWVRQMSGGGLEWMGRIDPGDSYYTTYNPSFQGHVTISIDKSTNTAYLHWNSLAASDTAMYYCARYYVSLVDIWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSVLTQPAKVSGSPGQKITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVNNRPSEVSNRFSGAKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTTGSRSVFGGGTKLTVLG