[发明专利]一种用于化妆品防腐剂的水母抗菌肽及其制备方法

权利要求书

1.一种水母抗菌肽，其特征在于，所述抗菌肽具有如下氨基酸序列：AACSDRAHGHICESFKSFCKDSGRNGVKLRANCKKTCGLC。

2. 一种权利要求1所述的水母抗菌肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）抗菌肽基因的合成

根据水母抗菌肽氨基酸序列，选用毕赤酵母偏好密码子，合成抗菌肽基因序列，并在其N端引入Kex2酶切位点，两端引入Xho I和Xba I酶切位点，以便于克隆入毕赤酵母表达载体中，另设计合成一对引物P1和P2，用于重组载体及重组酵母菌的鉴定，上游引物位于抗菌肽基因区，下游引物位于毕赤酵母3’AOX基因区；引物序列为：P1：5'—TCGTCGGGAATGCCCAAATC—3'，P2：5'—GCAGATTACAT'TCAAGTCATGC—3'；

（2）抗菌肽表达载体的构建与鉴定

将含抗菌肽基因的载体和表达载体均用Xho I和Xba I双酶切，酶切产物回收并连接，进行PCR测序鉴定；

（3）重组阳性质粒转化酵母菌株与筛选

阳性质粒经Sac I单酶切线性化后加入毕赤酵母感受态细胞悬液中，电转化后均匀涂布于含100 μg/mL Zeocin的YPDS选择平板上，28~30 ℃培养3~5天，待YPDS平板上的阳性转化子生长较大，将各转化子依次点种至含Zeocin 200 μg/mL，500 μg/mL，1000 μg/mL的YPDS选择平板，以在高浓度Zeocin平板上正常生长的菌落为可能高拷贝重组菌株；

提取可能的高拷贝重组酵母基因组DNA，以P1、P2为引物进行PCR反应，PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳观察，扩增的条带重组子进行阳性转化子鉴定；

（4）阳性克隆的诱导表达

将筛选到的阳性重组菌单菌落接种于含100 μg/mL Zeocin的YPD培养液中，28~30 ℃振摇培养18~24个小时，取此菌液按3~5%体积比转接于10 ml BMGY培养基中，28~30 ℃摇振培养12~20 h左右，OD600值为5~6，培养物直接转接于30~50 ml BMMY培养基中，28~30 ℃继续摇振培养，为了维持诱导表达，每隔15~20 h补加100%甲醇使终浓度达1~2%，40~50 h后，在4 ℃条件下，4000~6000 r/min离心10~15 min，收集上清，进行抑菌活性测定。

3.权利要求1和2所述的高产抗菌肽制剂具体制备工艺，其特征在于，包括如下步骤：

（1）将筛选得到的阳性重组子活化后按4~8%接种量接种于三角瓶，28~30 ℃，150~200 r/min摇床培养18~24 h后以4~8%接种量接入发酵罐，在28~30 ℃，150~200 r/min，pH值5.0~6.0，通气量0.5~1.0 VVM（1 L发酵液1 min通入的氧气量），溶氧>20%情况下进行发酵，在培养18~24 h后，流加50%甘油，待溶氧突然升至100%时流加甲醇至发酵结束，整个发酵持续48~72h；

（2）发酵结束后原罐蒸汽100 ℃灭菌10~15 min，放料，5000~6000 r/min离心10~20 min，收集发酵上清即为抗菌肽半成品；

（3）上述抗菌肽半成品喷雾干燥或冻干生产的粉剂和以生化方法精制、纯化后得到液体制剂，即为抗菌肽产品。

4.上述任一权利要求所述的抗菌肽产品作为化妆品防腐剂。