[发明专利]一种马链球菌兽疫亚种保护性抗原MAP及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体的，本发明涉及一种马链球菌兽疫亚种保护性抗原MAP及其制备方法。

背景技术

链球菌是一种常见的致病菌，根据细胞壁多糖抗原不同，可分为A、B、C…、V(缺I和J)20个群，其中A群链球菌(Group A Streptococci,GAS)主要对人致病，其他群主要对动物致病。B群链球菌(Group B Streptococci,GBS)和C群链球菌(Group C Streptococci,GCS)等群溶血性链球菌主要感染家畜和家禽，如GBS主要引起牛乳腺炎和猪脓疱症；GCS则主要引起马腺疫以及羊和猪败血症。

马链球菌兽疫亚种(Streptococcus zooepidemicus,SEZ)是GCS的一种，为β溶血性链球菌，目前国内对于SEZ的研究还有待进一步的深入。SEZ主要引起败血症、脑膜炎、心内膜炎、化脓性关节炎，还可引起马、猪、羊、牛等哺乳动物的乳房炎。此外，SEZ还可以感染人，主要通过接触感染SEZ的动物、排泄物等或其他日常工作而发生感染。虽然抗生素被广泛用于预防和治疗链球菌病，但随之而来的则是耐药性的产生和兽药残留等问题。因此，开发出效果较好的疫苗既可以解决抗生素滥用的问题，又有利于链球菌的防治。目前，对于SEZ毒力因素和保护性抗原的研究较少，从而很难开发出有效的亚单位疫苗来控制SEZ对动物的感染。因此提供一种保护性抗原对于SEZ的防治意义重大。

发明内容

有鉴于此，针对SEZ感染及防治问题，本发明提供了一种马链球菌兽疫亚种保护性抗原MAP及其制备方法。

本发明第一方面提供了一种马链球菌兽疫亚种保护性抗原MAP，为SEZMAP重组蛋白，由map基因编码，由807个氨基酸残基组成，分子量为87.02kDa，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明第二方面提供了上述链球菌保护性抗原MAP的制备方法，包含以下步骤：

S1、PCR扩增：使用马链球菌兽疫亚种基因组为模板，使用引物进行PCR扩增克隆map基因；

S2、与载体连接：PCR产物和pET-32a载体通过限制性酶酶切后连接；

S3、转化和诱导：将上述连接好的载体转化大肠杆菌后，待其OD为0.6～0.8时，加入终浓度0.4～1.0mmol/L IPTG后诱导3-5h；

S4、纯化：离心收集细菌沉淀并重悬，破碎后离心收集上清液，取上清液进行纯化，获得纯化的重组蛋白。

优选的，所述引物为：

正向引物：5’-CCCGGATCCGGTCAAGCGCATTTCTGAT-3’；

反向引物：5’-CTCAAGCTTTGAGGCAACCTTGGAGA-3’。

更加优选的，所述正向引物和反向引物各有1个酶切位点，分别为BamHI酶切位点和Hind III酶切位点。

本发明第三方面提供了上述马链球菌兽疫亚种保护性抗原MAP在制备马链球菌兽疫亚种疫苗中的应用。

本发明第四方面提供了上述马链球菌兽疫亚种保护性抗原MAP制备马链球菌兽疫亚种疫苗的方法，步骤包括：将成功表达并纯化的SEZ MAP重组蛋白与免疫佐剂乳化后作为疫苗，SEZ MAP重组蛋白浓度为100-200μg/mL。

本发明的有益效果为：

本发明提供一种马链球菌兽疫亚种保护性抗原MAP及其制备方法，采用该蛋白制备的疫苗的特异性强，通过克隆、诱导表达、层析纯化后得到的MAP重组蛋白。重组MAP蛋白可以和SEZ感染康复猪血清发生良好的免疫反应，重组MAP蛋白二免小鼠血清经ELISA检测显示，抗体滴度明显高于对照组，且所产生的抗体也以IgG1为主。重组MAP蛋白免疫小鼠后可以提供较高的保护效力，anti-MAP二免小鼠血清可以为小鼠提供明显的被动免疫保护。在SEZ感染的小鼠组织内提取分离的SEZ其map基因的转录水平要高于体外培养的SEZ的转录水平，MAP抗体还可以诱导高水平的杀菌能力。流式细胞术试验中，经MAP抗体处理细菌的平均荧光强度与空白对照组相比有较大的提升，证明MAP蛋白分布于SEZ的表面。

附图说明

图1.表示MAP蛋白的SDS-PAGE和Western blot结果。泳道M为蛋白预染Marker。泳道1～3分别为重组大肠杆菌非诱导、诱导表达MAP蛋白和Ni-NTA纯化后的MAP蛋白。泳道4为rMAP蛋白与SEZ康复期血清的免疫印记分析结果。结果表明rMAP具有良好的免疫原性。