[发明专利]一种快速测定无烟气烟草中曲霉毒素的方法

说明书

技术领域

本发明涉及微生物检测技术领域，特别是涉及一种快速测定无烟气烟草中曲霉毒素的方法。

背景技术

无烟气烟草是近年发展迅速的新型烟草类型，主要由烟草原料加工而成，含水率较高，一般通过口含进行使用。由于其原料直接来源于烟草，国外已有部分实验室检测到无烟气烟草中存在曲霉毒素。曲霉毒素是在土壤和植物中广泛存在的一类毒素，容易对人类所摄食的各种农作物进行感染，进而危害人们的身体健康。国家食品安全标准也明确了不同类型的食品相应的曲霉毒素限量标准。但国内目前尚没有相关检测方法，为进一步加强质量安全监管，需要建立快速有效的无烟气烟草中曲霉毒素的检测方法。

对于曲霉毒素的测定，主要有薄层色谱(TLC)，气相色谱质谱联用法(GC-MS)，高效液相色谱法(HPLC)，酶联免疫法(ELISA)和液相色谱质谱联用法(LC-MS/MS)。应用这些技术检测无烟气烟草中的曲霉毒素，有一些不足，如TLC自动化程度较低，GC衍生化繁琐，HPLC需要复杂的柱后衍生来达到所需的较高灵敏度。ELISA目前作为一种较为快速准确的检测方式，但其费用非常高。而LC-MS/MS是目前常用的高灵敏度检测方法，被用于多种样品基质中，适用于多组分分析，但是工作效率较低。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种快速测定无烟气烟草中曲霉毒素的方法，该测定方法直接用QuEChERS试剂进行前处理，简化了样品处理过程，再利用LC-HRMS进行检测，可同时检测黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2以及赭曲霉毒素A五种曲霉毒素，实现了无烟气烟草中曲霉毒素的快速、灵敏检测。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种快速测定无烟气烟草中曲霉毒素的方法，包括以下步骤：

1)样品前处理：将烟叶和/或烟丝样品烘干后，粉碎，过筛，得到烟末样品；

2)配制曲霉毒素混合标准溶液和内标溶液：将黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2和赭曲霉毒素A溶于乙腈中，定容，获得曲霉毒素混合标准溶液；将内标溶于乙腈中，定容，获得内标溶液；

3)提取曲霉毒素：将步骤1)得到的烟末样品中加入步骤2)获得的所述内标溶液，然后按照以下A)步骤操作，获得待测液；

A)再加入水、乙腈和乙酸的混合溶剂对烟末样品进行振荡，然后加入QuEChERS试剂包，振荡，然后第一次离心分离，提取上清液，吹干，然后加入甲醇水溶液进行复溶，超声，然后第二次离心分离，提取上清液；

4)配制标准工作溶液：

分别称取不含有曲霉毒素的烟草粉末样品基质，然后加入一系列不同体积的所述曲霉毒素混合标准溶液以及相同体积的所述内标溶液，待溶剂挥干后，然后按照A)步骤进行操作，获得一系列不同浓度的标准工作溶液；

5)采用液相色谱-高分辨率质谱同时检测标准工作溶液中的黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2和赭曲霉毒素A，建立相应的标准曲线；

6)采用液相色谱-高分辨率质谱同时检测步骤3)得到的待测液中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2和赭曲霉毒素A，根据步骤5)中建立的标准曲线进行定量分析。

优选地，在步骤1)中，所述烘干的温度为45-55℃。

优选地，在步骤2)中，所述内标包括d3-B1和d3-OTA，d3-B1和d3-OTA的重量比为1：1，所述d3-B1为氘代黄曲霉素B1，所述d3-OTA为氘代赭曲霉素A。

优选地，在步骤2)中，在曲霉毒素混合标准溶液中，黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2和赭曲霉毒素A的重量浓度均为10-2000ng/mL。

更优选地，在步骤2)中，在曲霉毒素混合标准溶液中，黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2和赭曲霉毒素A的重量浓度均为1000ng/mL。

优选地，在步骤2)中，所述内标溶液中d3-B1和d3-OTA的重量浓度分别为1-400ng/mL。

更优选地，在步骤2)中，所述内标溶液中d3-B1和d3-OTA的重量浓度分别为100ng/mL。

优选地，在步骤3)中，所述水、乙腈和乙酸的混合溶剂中水、乙腈和乙酸的体积比为(95-105)：(95-105)：(0.5-1.5)。

更优选地，在步骤3)中，所述水、乙腈和乙酸的混合溶剂中水、乙腈和乙酸的体积比为100：100：1。

优选地，在步骤3)中，超声振荡的频率为2000-3000r/min。

更优选地，在步骤3)中，超声振荡的频率为2500r/min。