[发明专利]磁性联合交联酶聚集体生物催化剂及其制备方法和应用

说明书

本发明提供一种磁性联合交联酶聚集体生物催化剂，在衍射角度2θ为30.5±0.2°、35.4±0.2°、44.7±0.2°、57.3±0.2°、63.4±0.2°处有衍射峰。本发明制备方法简单，不需要特殊设备，工艺条件温和，操作方法简单，成本低，适合工业化。使用本发明的磁性联合交联酶聚集体生物催化剂，用于不对称合成(R)‑3‑奎宁醇，可实现羰基还原和辅酶NADH/NAD⁺原位再生同时进行；同时能有效克服底物、辅酶和产物的扩散限制，催化活性好，催化效率高，同时大大缩短反应时间，经济价值明显。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种磁性联合交联酶聚集体生物催化剂及其制备方法和应用。

背景技术

(R)-3-奎宁醇(分子式C7H13NO，分子量为127.18，CAS号：25333-42-0)是合成阿地溴铵、索利那新和瑞伐托酯等药物的关键性手性中间体。目前工业上主要是利用手性催化剂，如：XylSkewphos/PICA-Ruthenium(II)复合物或BINAP/IPHAN-Ru(II)复合物等，不对称还原3-奎宁酮合成(R)-3-奎宁醇，但该化学合成方法需筛选手性配体；所使用的过渡金属价格昂贵、毒性较大、难以从产物中去除；而且制备的产物光学纯度较低，需进一步纯化。另一种方法是外消旋拆分，该方法的缺陷在于其理论产率最大只有50％。

相对于化学合成方法，基于酶的生物合成法具有底物特异性；高度化学选择性、区域选择性和立体选择性；反应条件温和；催化活性高；原子经济性好等独特优势。生物方法合成(R)-3-奎宁醇涉及两个过程：一是借助羰基还原酶利用NADH或NADPH将3-奎宁酮还原为(R)-3-奎宁醇；二是借助辅酶再生酶将氧化型NAD⁺或NADP⁺转化为还原型NADH或NADPH，实现双酶偶联不对称还原合成(R)-3-奎宁醇。具体过程如下：

生物催化不对称还原合成(R)-3-奎宁醇过程

无论是用野生型微生物全细胞还是重组微生物全细胞作为生物催化剂，由于细胞本身结构的限制，致使底物/产物、辅酶在细胞内外扩散受阻，导致生物转化时间长、催化效率低。而游离酶被认为是化学工业合成中最为有效的手性催化合成工具之一。但在实际的生产应用过程中，由于酶生物催化剂脱离酶所依赖的自然环境，致使其稳定性降低、催化活性低。尽管通过定向进化、基因重排和定点突变等生物分子工程技术能改善酶的稳定性和催化活性，但技术难道大、酶纯化成本高、回收过程复杂、易致产品污染、难以循环利用等问题严重阻碍了酶的商业化以及在工业领域的催化应用。

酶固定化技术既能有效克服游离酶生物催化剂的缺陷，又能提高酶的稳定性和催化活性，易于从反应混合物中分离和循环再利用，实现连续反应，降低生产成本(RobertDicosimo,Joseph Mcauliffe,Ayrookaran J.Pouloseb and Gregory Bohlmann,Industrial use of immobilized enzymes,Chem.Soc.Rev.,2013,42,6437-6474)。但基于载体的物理吸附、化学键结合和包埋等酶固定化方法：需使用高纯度的酶，致使生产成本增加；需使用无催化活性的载体，导致酶的体积活性、时空产率和催化产率降低。基于无载体的交联酶聚集体(CLEAs)是一种快速、简单和低成本的固定化方法：无需高纯度酶，生产成本降低；能直接从发酵液中一步实现纯化和固定化单酶(完成一步反应)或多酶(完成级联反应)；能提高酶的长期操作稳定性和催化活性；能循环再利用。但是CLEAs质软、机械性能差、易聚集成块、难以过滤回收，这些缺陷都阻碍了CLEAs的工业化应用。

发明内容

为了解决现有技术中的问题，根据本发明的第一方面，本发明的目的在于提供一种磁性联合交联酶聚集体(combi-CLEAs)生物催化剂，该生物催化剂能用于催化级联反应、长期操作稳定性好、催化活性高、易于磁分离和可循环再利用。