[发明专利]将人源胚胎干细胞体外诱导为卵泡的方法及其所用培养基

说明书

本发明公开了一种将人源胚胎干细胞体外诱导为卵泡的方法及其所用培养基。本发明通过在人源胚胎干细胞中高表达DAZL和BOULE外源基因，同时加入GDF9和BMP15等生长因子进行内源刺激的方法，成功在体外获得人卵泡。本发明首次建立了人源胚胎干细胞向卵泡的体外分化方法。不仅突破了体外研究人早期生殖细胞发育及卵泡发生等发育机理的瓶颈，而且还为研究早期受精卵发育机理提供材料，也为治疗卵巢早衰等女性不孕症提供新的思路。

技术领域

本发明属于细胞培养领域，具体涉及将人源胚胎干细胞体外诱导为卵泡的方法及其所用培养基。

背景技术

人源胚胎干细胞H9细胞系来源于原肠胚之前的人体胚胎，经过数代的培养形成的细胞系具有体外无限增殖，自我更新且具有多功能干性等特点。胚胎干细胞能分化为体内的三个胚层的细胞。胚胎干细胞体外定向分化的研究有助于了解胚胎发育的机制及为再生医学的临床研究提供方法。

卵泡由卵母细胞及周围的卵泡颗粒细胞(granulosa cell)组成，二者之间相互联系。卵泡的发育阶段大致可分为原始卵泡、初级卵泡、腔前卵泡、有腔卵泡，最终有腔卵泡排出成熟的可受精的卵细胞。大部分的原始卵泡会处于休眠期，每一个生殖周期会激活一些原始卵泡形成初级卵泡，但一般只有一个卵泡能最终成熟并排卵，这个过程同时伴随一部分原始卵泡的凋亡。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种将胚胎干细胞体外诱导为卵泡的成套培养基。

本发明提供的成套培养基包括培养基1、培养基2和培养基3；

所述培养基1、所述培养基2和所述培养基3均为哺乳动物细胞分化培养基，所述培养基1含有骨形态发生蛋白4(BMP4)和骨形态发生蛋白8a(BMP8a)，所述培养基2含有GDF9:BMP15二聚体蛋白和表皮生长因子(EGF)，所述培养基3含有生长分化因子9(GDF9)和骨形态发生蛋白15(BMP15)；

所述GDF9:BMP15二聚体蛋白是由GDF9蛋白和BMP15蛋白组成的二聚体蛋白。

所述培养基1中的骨形态发生蛋白4(BMP4)和骨形态发生蛋白8a(BMP8a)是单独的形式。所述培养基3中的生长分化因子9(GDF9)和骨形态发生蛋白15(BMP15)也是单独的形式。

上述成套培养基中，所述成套培养基由成套使用的所述培养基1、所述培养基2、所述培养基3、培养基4和培养基5组成；

所述培养基4是将滋养层细胞在胚胎干细胞培养基中培养后得到的培养基；

所述培养基5是在所述培养基4中添加杀稻瘟菌素后得到的培养基。

所述骨形态发生蛋白15的氨基酸序列为序列11；所述生长分化因子9的氨基酸序列为序列12。

上述成套培养基中，所述胚胎干细胞培养基是将基础培养基、血清替代物、L-谷氨酰胺、甘氨酸、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、碱性成纤维细胞生长因子(FGF)、青霉素和链霉素混匀得到的液体培养基；

所述哺乳动物细胞分化培养基是将基础培养基、胎牛血清、L-谷氨酰胺、甘氨酸、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、青霉素和链霉素混匀得到的液体培养基；

所述培养基1是在所述哺乳动物细胞分化培养基中添加所述BMP4和所述BMP8a后得到的液体培养基；

所述培养基2是在所述哺乳动物细胞分化培养基中添加所述GDF9:BMP15二聚体蛋白和所述EGF后得到的液体培养基；

所述培养基3是在所述哺乳动物细胞分化培养基中添加所述GDF9和所述BMP15后得到的液体培养基。

上述成套培养基中