[发明专利]将人源胚胎干细胞体外诱导为卵泡的方法及其所用培养基

权利要求书

1.将胚胎干细胞体外诱导为卵泡的产品，包括成套培养基、表达DAZL的慢病毒和表达BOULE的慢病毒；

所述成套培养基由成套使用的所述培养基1、所述培养基2、所述培养基3、培养基4和培养基5组成；

所述培养基1是在哺乳动物细胞分化培养基中添加骨形态发生蛋白4和骨形态发生蛋白8a后得到的液体培养基；

所述培养基2是在哺乳动物细胞分化培养基中添加GDF9:BMP15二聚体蛋白和表皮生长因子后得到的液体培养基；所述GDF9:BMP15二聚体蛋白是由生长分化因子9和骨形态发生蛋白15组成的二聚体蛋白；

所述培养基3是在哺乳动物细胞分化培养基中添加生长分化因子9和骨形态发生蛋白15后得到的液体培养基；

所述培养基4是将滋养层细胞在胚胎干细胞培养基中培养后得到的培养基；

所述培养基5是在所述培养基4中添加杀稻瘟菌素后得到的培养基；

所述哺乳动物细胞分化培养基是将基础培养基、胎牛血清、L-谷氨酰胺、甘氨酸、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、青霉素和链霉素混匀得到的液体培养基；

所述胚胎干细胞培养基是将基础培养基、血清替代物、L-谷氨酰胺、甘氨酸、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、碱性成纤维细胞生长因子、青霉素和链霉素混匀得到的液体培养基；

所述骨形态发生蛋白4在所述培养基1中的浓度为150 ng/ml；

所述骨形态发生蛋白8a在所述培养基1中的浓度为50 ng/ml；

所述GDF9:BMP15二聚体蛋白在所述培养基2中的浓度为0.35 ng/ml；

所述表皮生长因子在所述培养基2中的浓度为10 ng/ml；

所述生长分化因子9在所述培养基3中的浓度为50 ng/ml；

所述骨形态发生蛋白15在所述培养基3中的浓度为25 ng/ml；

所述杀稻瘟菌素在所述培养基5中的浓度为2 μg/ml；

所述血清替代物在所述胚胎干细胞培养基中的体积分数为20 %；

所述碱性成纤维细胞生长因子在所述胚胎干细胞培养基中的浓度为 8 ng/ml；

所述胎牛血清在所述哺乳动物细胞分化培养基中的体积分数为10 %；

所述 L-谷氨酰胺在所述胚胎干细胞培养基和所述哺乳动物细胞分化培养基中的浓度均为1 mM；

所述甘氨酸在所述胚胎干细胞培养基和所述哺乳动物细胞分化培养基中的浓度均为7.5 mg/L；

所述L-丙氨酸在所述胚胎干细胞培养基和所述哺乳动物细胞分化培养基中的浓度均为8.9 mg/L；

所述L-天冬酰胺在所述胚胎干细胞培养基和所述哺乳动物细胞分化培养基中的浓度均为 13.2 mg/L；

所述L-天冬氨酸在所述胚胎干细胞培养基和所述哺乳动物细胞分化培养基中的浓度均为13.3 mg/L；

所述L-谷氨酸在所述胚胎干细胞培养基和所述哺乳动物细胞分化培养基中的浓度均为 14.7 mg/L；

所述L-脯氨酸在所述胚胎干细胞培养基和所述哺乳动物细胞分化培养基中的浓度均为 11.5 mg/L；

所述L-丝氨酸在所述胚胎干细胞培养基和所述哺乳动物细胞分化培养基中的浓度均为 10.5 mg/L；

所述青霉素在所述胚胎干细胞培养基和所述哺乳动物细胞分化培养基中的浓度均为100 I.U；

所述链霉素在所述胚胎干细胞培养基和所述哺乳动物细胞分化培养基中的浓度均为100μg/ml；

所述胚胎干细胞为人胚胎干细胞H9细胞系。

2.下述A1或A2的制备方法：

A1、权利要求1中所述成套培养基的制备方法，包括如下步骤：分别制备所述培养基1、所述培养基2、所述培养基3、所述培养基4和所述培养基5，再将所述培养基1、所述培养基2、所述培养基3、所述培养基4和所述培养基5分别进行独立包装，得到所述成套培养基；

A2、权利要求1所述产品的制备方法，包括如下步骤：将权利要求1中所述成套培养基、所述表达DAZL的慢病毒和所述表达BOULE的慢病毒分别进行单独包装，得到所述产品。

3.权利要求1中所述成套培养基在制备将胚胎干细胞体外诱导为卵泡的产品中的应用；所述胚胎干细胞为人胚胎干细胞H9细胞系。