[发明专利]一种基于重组S1蛋白检测猪流行性腹泻病毒IgA抗体的ELISA方法

说明书

技术领域

本发明涉及检测猪流行性腹泻病毒的方法，特别是一种基于重组S1蛋白检测猪流行性腹泻病毒IgA抗体的ELISA方法。

背景技术

猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea，PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的猪的一种以呕吐、腹泻和脱水为主要临床症状的肠道传染病。该病已成为制约我国养猪业健康发展的重要猪病之一。

作为猪的一种肠道病毒，PEDV引起的免疫应答主要以肠道粘膜免疫为主。实践中，血清学检测仍然是PEDV临床诊断及免疫评价的常用方法。遗憾的是，目前的抗体检测技术主要集中在血液中IgG抗体水平的检测，而临床检测发现，尽管疫苗免疫后血清中存在较高水平的抗PEDV IgG抗体，猪群仍发生腹泻的情况时常发生。因此，传统检测血清中的PEDV IgG抗体水平不能真实反映PEDV疫苗的免疫保护状况。对于肠道病毒来说，IgA是病原体感染后肠道粘膜产生最多的抗体类型，也是阻止病原体入侵肠道的重要防线，在机体抗感染免疫中发挥重要作用。因此，对于PEDV来说，猪体内IgA水平更能反应机体被PEDV感染情况及疫苗免疫保护效力。目前对于IgA的检测仍存在一定难度，国内尚缺乏标准的PEDV IgA检测技术和产品。

发明内容

本发明根据流行毒株CH/HNQX-3/14的S1基因序列设计引物，扩增产物编码的蛋白包含了S1蛋白的499-638aa、748-755aa和756-771aa三个中和表位区。将其构建重组表达质粒pET30a(+)-pS1，转化大肠杆菌BL21后，通过优化表达条件，获得了可溶性表达的重组pS1蛋白，采用Ni-NTA亲和层析对其进行纯化，以纯化后的重组pS1蛋白为抗原包被酶标板，建立了PEDV IgA抗体间接ELISA检测方法，该方法具有良好的特异性、敏感性和重复度，可用于PEDV的临床检测及疫苗免疫评价。

本发明的目的是提供一种高通量检测PEDV IgA抗体的ELISA方法，该方法具有特异性强、灵敏度高、结果准确可靠的特点，可用于PEDV的疫苗免疫评价。

本发明的技术方案是，一种基于重组S1蛋白检测猪流行性腹泻病毒IgA抗体的ELISA方法，它包括以下步骤：

步骤1：

重组pS1蛋白可溶性表达体系的建立

构建重组表达质粒pET30a(+)-pS1，转化大肠杆菌BL₂₁后，通过优化表达条件，获得了可溶性表达的重组pS1蛋白，具体为：

(1)pS1重组表达质粒的构建

采用上游引物：5'-GGGGATCCTCTTTTGTTACTTTGCC-3’河下游引物：5’-GCGAATTCAGGCGTGTTGTAAAGC-3’扩增pS1基因，上下游分别引入BamHI和EcoRI酶切位点，将该基因克隆至pET30a(+)载体，构建重组表达质粒pET30a(+)-pS1；

(2)确定诱导前菌液OD₆₀₀值

诱导前首先测定菌液OD₆₀₀值，然后加入1.0mM IPTG，置于37℃摇床250rpm诱导表达10h，菌体经8000rpm离心15min后超声破碎；每工作5s，间隔5s，15min，12000rpm离心10min，分别对上清和沉淀进行12﹪SDS-PAGE电泳，根据蛋白表达情况，确定诱导前菌液最佳OD₆₀₀值为0.6；

(3)重组pS1蛋白诱导表达温度的优化

菌液培养至以上确定的OD₆₀₀值时加入1.0mM IPTG，分别置于20℃～37℃摇床250rpm培养10h，菌体经离心及超声破碎处理后，12﹪SDS-PAGE电泳，根据沉淀和上清中目的蛋白的表达情况，确定30℃为最佳诱导表达温度；

(4)IPTG工作浓度的优化

按以上确定的最佳诱导温度，向菌液中加入终浓度分别为0.1～1.2mM的IPTG诱导表达10h，超声破碎菌体，12000rpm离心10min，分别收集上清和沉淀，采用12﹪SDS-PAGE电泳观察蛋白表达情况，确定IPTG的最佳诱导工作浓度为0.8mM；

(5)重组pS1蛋白诱导表达时间的优化