[发明专利]一种基于重组S1蛋白检测猪流行性腹泻病毒IgA抗体的ELISA方法

权利要求书

1.一种基于重组S1蛋白检测猪流行性腹泻病毒IgA抗体的ELISA方法，其特征在于：它包括以下步骤：

步骤1：

重组pS1蛋白可溶性表达体系的建立

构建重组表达质粒pET30a(+)-pS1，转化大肠杆菌BL₂₁后，通过优化表达条件，获得了可溶性表达的重组pS1蛋白，具体为：

（1）pS1重组表达质粒的构建

采用上游引物：5'- GGGGATCCTCTTTTGTTACTTTGCC-3’河下游引物：5’- GCGAATTCAGGCGTGTTGTAAAGC-3’扩增pS1基因，上下游分别引入BamHI和EcoRI酶切位点， 将该基因克隆至pET30a(+)载体，构建重组表达质粒pET30a(+)-pS1；

（2）确定诱导前菌液OD₆₀₀值

诱导前首先测定菌液OD₆₀₀值，然后加入1.0 mM IPTG，置于37 ℃摇床250 rpm诱导表达10 h，菌体经8000 rpm离心15 min后超声破碎；每工作5 s，间隔5 s，15 min，12000 rpm离心10min，分别对上清和沉淀进行12 ﹪SDS-PAGE电泳，根据蛋白表达情况，确定诱导前菌液最佳OD₆₀₀值为0.6；

（3）重组pS1蛋白诱导表达温度的优化

菌液培养至以上确定的OD₆₀₀值时加入1.0 mM IPTG，分别置于20 ℃～37 ℃摇床250 rpm培养10 h，菌体经离心及超声破碎处理后，12 ﹪SDS-PAGE电泳，根据沉淀和上清中目的蛋白的表达情况，确定30 ℃为最佳诱导表达温度；

（4）IPTG工作浓度的优化

按以上确定的最佳诱导温度，向菌液中加入终浓度分别为0.1～1.2 mM的IPTG诱导表达10 h，超声破碎菌体，12000 rpm离心10min，分别收集上清和沉淀，采用12 ﹪SDS-PAGE电泳观察蛋白表达情况，确定IPTG的最佳诱导工作浓度为0.8 mM；

（5）重组pS1蛋白诱导表达时间的优化

根据以上确定的诱导表达条件，从诱导2 h开始，每隔2 h收样一次，直到诱导20 h结束，超声处理诱导后菌液，12000 rpm离心10 min，12 ﹪SDS-PAGE电泳观察蛋白表达情况，确定最佳诱导时间为8 h；

步骤2：

重组pS1蛋白的Ni-NTA亲和层析纯化

（1）装住：将柱子垂直固定于离心管架子上，取20 mL填料加入柱子中，沉积30 min；

（2）将镍柱接入ÄKTA explorer 10蛋白纯化仪，打开Biologic DuoFlow程序；

（3）平衡：用至少10倍柱床体积的Bind buffer：300 mM NaCl，50 mM NaH₂PO₄，10 mM Imidazole，pH 8.0，对柱子平衡2次；

（4）上样：将待纯化蛋白循环上样3-5次。注意保存流穿过的蛋白液，比较过柱前后目的蛋白的浓度变化；

（5）洗涤：用Washing Buffer：300 mM NaCl，50 mM NaH₂PO₄，50 mM Imidazole，pH 8.0，反复洗涤杂蛋白，用蛋白指示剂检测蛋白浓度的变化；

（6）洗脱：用Elution Buffer：300 mM NaCl，50 mM NaH₂PO₄，200 mM Imidazole，pH 8.0，洗脱目的蛋白，SDS-PAGE及Western-blot鉴定分析洗脱效果；

（7）柱子保存：分别用5-10倍柱体积的Binding buffer和超纯水对柱子进行清洗，再加入20 ﹪乙醇4 ℃保存；

步骤3：

pS1-ELISA方法的建立

（1）包被：表达的重组pS1蛋白按1.25 µg/mL浓度用0.05 M CBS，pH 9.6包被于96孔板，50 µL/孔，4 ℃过夜，取出后用PBST洗涤5次；

（2）封闭：每孔加入200 µL的1 ﹪BSA作为封闭液，置于37 ℃条件下封闭90 min，洗涤5次；

（3）加样：样品用PBS稀释后按每孔50 µL加入酶标板，并加入阴性和阳性对照，37 ℃作用30 min，洗涤5次；

（4）加入酶标二抗：山羊抗猪IgA酶标二抗按1:4000倍稀释后，按每孔50 µL量加入以上酶标孔，37 ℃反应30 min，洗涤5次；

（5）显色与终止：按50 µL/孔的量加入TMB显色液，避光条件下显色10 min，加入2 M H₂SO₄终止反应，用酶标仪测定OD₄₅₀值；

（6）结果判定：利用以上方法检测36份PEDV阴性血清，测定OD₄₅₀值，计算平均值：和标准差：SD，当待检血清OD_450nm ≥＋3SD，且阴性对照OD_450nm＜0.12时即可判为阳性，其它判为阴性，最终确定阴、阳性的临界值为0.43。