[发明专利]一种从土壤中特异性分离酸杆菌的方法

说明书

技术领域

本发明涉及的领域为现代分子生物学技术和微生物技术的交叉领域，具体的说为一种基于特异性引物-PCR结合改良后的基本培养基平板特异性分离酸杆菌的方法。

背景技术

酸杆菌(Acidobacteria)最初的发现是由日本的Kishimoto等于1991年发现，酸杆菌作为土壤微生物群落中的重要组成部分，其相对丰度仅次于土壤中的变形菌门，约占土壤细菌总量的20～50％，而在某些特定环境中，如栗树根际土壤中，作为土壤中的绝对优势微生物类群，其相对丰度可达到65％。酸杆菌门在环境的分布极为广泛，包括自然环境以至于一些极端环境与污染环境，而且酸杆菌在驱动土壤物质循环和生态环境构建过程当中具有重要的生态学意义。

近几年的研究发现根据系统发育研究结果可以将酸杆菌下分为27种不同纲水平微生物。对土壤微生物宏基因组测序表明，酸杆菌具有降解植物中纤维素相关基因，以此推测在环境较为恶劣的情况下，如酸性、低温环境中，相比于其他微生物，对恶劣环境强适应性的酸杆菌所具备的纤维素降解能力就尤为突出；酸杆菌对于所处生境中的铁元素循环也起到积极作用，如可在葡萄糖发酵过程中形成Fe(Ⅱ)，为发酵过程中的其他微生物提供必要的养分。

酸杆菌的纯化菌株很难通过人工培养获得，因此对于该类群微生物的表型、生理特征以及机理研究极为稀少。近年来针对酸杆菌的研究多是以分子生物学手段为基础，通过16S rDNA对酸杆菌的遗传多样性开展了诸多研究。但是关于通过培养实验以快速获得酸杆菌单菌株的方法尚未见报道，极大的影响了对于酸杆菌的生态学价值的研究，并降低了探索其潜在其他价值的可能性。

目前，国内外以16S rDNA为基础对酸杆菌开展的研究多是以细菌的通用引物为主，而细菌的通用引物虽然可以在门水平上为微生物多样性的划分提供依据，但是在更为精细的分类水平上，则需要设计针对该门类微生物的特异性引物。因此目前仍然缺乏具备足够特异性的高效引物完成对酸杆菌16S rDNA的特异性扩增。

发明内容

本发明旨在提供一种基于特异性引物-PCR结合改良后的MM平板特异性分离酸杆菌的方法。

为完成以上目标，本发明的基本方案为：

一种基于门水平的特异性引物-PCR结合改良后的基本培养基平板特异性分离酸杆菌的方法。方法为，将样品悬浊液稀释涂布到改良后的固体基本培养基平板，选择白色单菌落继续采用连续划线平板法纯化，将纯化后的单菌落经液体培养基扩大培养，提取基因组DNA，应用酸杆菌门特异性引物PCR扩增16S rDNA片段，若得到片段大小为1462的阳性扩增产物，即表明筛选得到该样品中的酸杆菌。

酸杆菌门特异性引物Acido_31F：5‘-GATCCTGGCTCAGAATC-3’，Acido_1492R：5‘-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’

具体操作方案为：

1)土壤悬浊液的制备：首先称取5g待测土壤至于50ml已灭菌的锥形瓶并添加少量玻璃珠，而后向其中加入45ml生理盐水于150rpm条件下振荡90min，使土壤微生物充分溶于生理盐水中；振荡结束后，于室温下静置30min，采用生理盐水对静置后的土壤上清液按照10倍的梯度进行连续稀释；

2)涂布稀释后的上清液至改良后的MM固体培养基：吸取上一步中得到的稀释后的样液(稀释度以10-4为宜)，采用涂布平板法涂布，于30℃下培养3～6天；

3)连续划线平板法纯化：接种环挑取上一步中得到的单菌落，在改良后的固体基本培养基上连续划线以达到分离纯化的目的；

4)纯培养菌株基因组DNA的提取：将步骤3中分离纯化后得到的单菌落接种于改良后的液体基本培养基，30℃下150rpm振荡培养过夜，而后采用溶菌酶、蛋白酶K和氯仿/异戊醇提取纯培养菌株的基因组DNA；

5)特异性引物扩增纯菌株的16S rDNA片段：采用特异性引物Acido_31F：5‘-GATCCTGGCTCAGAATC-3’，Acido_1492R：5‘-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’，以步骤4中提取得到的纯培养菌株的基因组DNA为模板进行PCR扩增。扩增后的产物经由2％的琼脂糖凝胶电泳检测，若成功得到阳性PCR产物且扩增片段大小为1462bp，即可证明筛选得到酸杆菌，若未获得阳性PCR产物则证明未筛选得到酸杆菌(原因可能为土壤中酸杆菌含量过低，致使筛选未成功)。