[发明专利]一种从土壤中特异性分离酸杆菌的方法

权利要求书

1.一种从土壤中特异性分离酸杆菌的方法，其特征在于：其为基于门水平上的特异性引物-PCR结合改良后的基本培养基平板从土壤中特异性分离酸杆菌，将待处理土壤样品悬浊液涂布于pH为3.5～4.5的基本培养基固体平板培养，选择白色单菌落继续采用连续划线平板法纯化，将纯化后的单菌落经液体培养基扩大培养，提取细菌基因组DNA，应用酸杆菌门特异性引物PCR扩增16S rDNA片段，若得到片段大小为1462bp的阳性扩增产物，即表明筛选得到该样品中的酸杆菌；

酸杆菌门特异性引物Acido_31F：5‘-GATCCTGGCTCAGAATC-3’，Acido_1492R：5‘-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。

2.根据权利要求1所述的特异性分离酸杆菌的方法，其特征在于：

1)土壤悬浊液的制备：首先称取5g待处理土壤至于已灭菌的锥形瓶并添加玻璃珠，而后向其中加入40－50ml生理盐水于150－180rpm条件下振荡80－100min，使土壤微生物充分溶于生理盐水中；振荡结束后，于室温下静置20－40min，采用生理盐水对静置后的土壤上清液进行稀释，浓度范围为原上清液体积浓度的10^-3－10^-6(稀释度以10^-4为宜)；

2)涂布样液至改良后的固体基本培养基：吸取上一步中得到的稀释后的样液，采用涂布平板法涂布，于30℃下培养3～6天；

3)连续划线平板法纯化：接种环挑取上一步中得到的单菌落，在改良后的固体基本培养基平板上连续划线培养以达到分离纯化的目的；

4)纯培养菌株基因组DNA的提取：将步骤3)中分离纯化后得到的单菌落接种于改良后的液体基本培养基，30℃下150-180rpm振荡培养过夜，而后依次采用溶菌酶破坏细菌细胞壁、蛋白酶K去除蛋白质影响和氯仿/异戊醇提取纯培养菌株的基因组DNA；

5)特异性引物扩增纯菌株的16S rDNA片段：采用特异性引物Acido_31F：5‘-GATCCTGGCTCAGAATC-3’，Acido_1492R：5‘-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’，以步骤4)中提取得到的纯培养菌株的基因组DNA为模板进行PCR扩增；扩增后的产物经由质量浓度2％的琼脂糖凝胶电泳检测，若成功得到阳性PCR产物且扩增片段大小为1462bp，即可证明筛选得到酸杆菌。

3.按权利要求2所述的特异性分离酸杆菌的方法，其特征在于：改良后的固体基本培养基配方为:KH₂PO₄ 1.5g，MgSO₄ 7H₂O 0.2g，蔗糖30g，酵母提取物50mg，琼脂粉20g，用蒸馏水定容至1000ml，采用1mol/L的HCL溶液调节pH至3.5-4；

改良后的液体基本培养基配方为:KH₂PO₄ 1.5g，MgSO₄ 7H₂O 0.2g，蔗糖30g，酵母提取物50mg，用蒸馏水定容至1000ml，采用1mol/L的HCL溶液调节pH至3.5-4。

4.按权利要求2所述的特异性分离酸杆菌的方法，其特征在于：所述步骤5)PCR扩增PCR反应体系组成如下：2μl DNA模板，PCR master mixture 12.5μl，引物Acdio_31F 1μl(20pmol/L)引物Acido_1492R 1μl(20pmol/L),Taq酶(5U/μl)0.25μl，甘油5μl，加灭菌去离子水至总体积为50μl；PCR反应条件：95℃预变性4min，95℃变性40s，55℃退火40s，72℃延伸90s，35个循环，最后72℃延伸10min，PCR结束后的保存条件为4℃。

5.按权利要求2所述的特异性分离酸杆菌的方法，其特征在于：所述步骤4)中所提取的纯培养菌株基因组DNA：将3)中经分离纯化后的菌落接种于改良后的液体基本培养基，首先收集酸杆菌菌体，于25℃条件下，150rpm振荡过夜培养，8 000rpm离心5～8min收集菌体，弃去上清液；加入TES缓冲液(Tris-HCl终浓度50mM，EDTA终浓度5mM，NaCl终浓度50mM，调节pH至8.0)冲洗菌体，而后将菌体溶于20ml的TES缓冲液；加入50mg溶菌酶(终浓度2mg/ml)，于37℃条件下孵育30～40min，孵育过程中每隔10min上下颠倒混匀一次；加入1.6ml的20％SDS(终质量浓度2％)，于60℃条件下水浴30min；加入3.6ml的5M次氯酸钠(NaClO4)(终浓度1M)充分混匀；加入相同体积的的氯仿：异戊醇混合溶液(体积配比为24:1)，上下颠倒混匀使液体呈现乳白色浑浊状，而后8000rpm(4℃)离心10min；取上清液置于灭菌后的烧杯中，加入等体积的预冷(至4℃)的异丙醇，将析出的DNA丝状沉淀用灭菌的玻璃棒搅起而后溶于10ml TES缓冲液中；加入50μl 10mg/ml RNase A(终浓度50μg/ml)在37℃下消化20～30min以去除RNA对后续实验的影响；加入100μl的10mg/ml蛋白酶K(Proteinase K)(终浓度100μg/ml)在37℃下消化120～150min；加入等体积的氯仿：异戊醇混合溶液(体积配比为24:1)，充分混匀，待其乳化后在4℃条件下，8000rpm离心10min；将上清液转移至一灭菌后的洁净烧杯中，加入等体积预冷(至4℃)的异丙醇和1/10体积的3M CH₃COONa，用玻璃棒将析出的DNA丝挑起；而后采用体积浓度为70％的乙醇溶液脱盐5～7min，空气中自然晾干以使酒精挥发干净；将缠有DNA丝的玻璃棒放在3-5ml双蒸水(ddH2O)(含20μg/mL的RNase A)中，4℃孵育至DNA全部溶解。