[发明专利]一种肝癌早期检测试剂盒的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及肝癌检测技术领域，尤其涉及一种肝癌早期检测试剂盒的制备方法。

背景技术

原发性肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一，位居肿瘤死亡的第二位，我国每年约有13万人死于肝癌，占全球新发肝癌人数的一半以上。大多数肝癌患者就诊时已届中、晚期，错失最佳治疗时机，早期诊断和早期治疗是防治肝瘤和降低死亡率的最有效办法。目前肝癌的早期诊断主要依靠影像学检查与肿瘤标志物的测定，肿瘤标志物的测定具有敏感性、特异性高，痛苦少等优点越来越受到重视。

肿瘤标志物的检测主要是通过免疫学的方法。在免疫学分析与检测中，由于生物大分子结构比较复杂，直接检测较困难，所以通常在免疫检测体系中引入荧光探针技术，即用荧光素等小分子标记生物大分子，利用适当的仪器检测荧光标记物的信号，达到检测的目的。传统的荧光探针包括异硫氰酸荧光素(FITC)、荧光素、罗丹明(Rodam)等。很多生物样品(如血清)其本身荧光位于400～600nm，而传统荧光探针的荧光发射波长处于可见光区，二者重叠区域较大，造成自然本底荧光干扰，影响检测的敏感性，而且传统荧光探针存在非特异性吸附，严重阻碍免疫荧光技术的发展。且传统的藻胆蛋白荧光探针的制备多采用化学交联技术。化学交联是指在热、光、高能辐射、超声波、机械力、交联剂等作用下，利用化学键将大分子链连结起来，形成体形或网状结构高分子的过程。如果采用化学交联技术将藻胆蛋白和酶标记，则反应后酶的活性可能会降低，而且化学交联的前期准备工作较复杂，需要单独纯化各种交联原材料，交联副产物较多。

发明内容

鉴于此，有必要提供一种灵敏度高、副产物少的的肝癌早期检测试剂盒的制备方法。

一种肝癌早期检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

将肝癌表面抗原用PBST溶液配制成浓度为0.1-100ng/mL的肝癌表面抗原溶液，置于4-6℃备用；

将抗所述肝癌表面抗原的单克隆抗体用PBST溶液配制成浓度为5-10μg/mL抗肝癌表面抗原的单克隆抗体溶液，置于4-6℃备用；

将荧光酶标板用所述抗肝癌表面抗原的单克隆抗体溶液在4-6℃包被16-20小时，弃去溶液；

将所述荧光酶标板用PBST溶液冲洗；

将所述荧光酶标板采用含有质量分数为5％的脱脂牛奶或小牛血清白蛋白的PBST溶液在4-6℃进行非结合位点的封闭；

将所述荧光酶标板用PBST溶液冲洗；

在所述荧光酶标板中，每孔中加入所述肝癌表面抗原溶液，于20-24℃孵育1-2小时；

将所述荧光酶标板用PBST溶液冲洗；

在所述荧光酶标板中，每孔中加入生物素化的抗肝癌表面抗原的单克隆抗体的PBST溶液，于20-24℃孵育1-2小时；

将所述荧光酶标板用PBST溶液冲洗；

在所述荧光酶标板中，每孔加入重组藻蓝蛋白亚基的PBST溶液，于20-24℃孵育1-2小时；

将所述荧光酶标板用PBST溶液冲洗，得到所述肝癌早期检测试剂盒。

在其中一个实施例中，所述PBST溶液包含有20mM KH₂PO₄、100mM Na₂HPO₄·12H₂O、1.37M NaCl、27mMKCl和质量分数为0.05％的吐温20，pH为7.4。

在其中一个实施例中，所述肝癌表面抗原为AFP或CEA。

在其中一个实施例中，所述荧光酶标板为96孔板或48孔板。

在其中一个实施例中，所述重组藻蓝蛋白亚基包括藻胆蛋白蛋白亚基、色基、麦芽糖结合蛋白、链霉亲和素核心蛋白。

在其中一个实施例中，将荧光酶标板用所述抗肝癌表面抗原的单克隆抗体溶液在4-6℃包被16-20小时，弃去溶液的步骤中，所述抗肝癌表面抗原的单克隆抗体溶液的用量为200-250μL。

在其中一个实施例中，在所述荧光酶标板中，每孔中加入所述肝癌表面抗原溶液，于20-24℃孵育1-2小时的步骤中，所述肝癌表面抗原溶液的用量为100μL。

在其中一个实施例中，所述生物素化的抗所述肝癌表面抗原的单克隆抗体溶液的终浓度为5-10μg/mL，用量为100μL。

在其中一个实施例中，所述重组藻蓝蛋白亚基的PBST溶液的终浓度为30-50μg/mL，用量为100μL。