[发明专利]一种核壳式磁性复合微球及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种核壳式磁性复合微球及其制备方法和应用，具体涉及一种具有温敏特性的核壳式磁性复合微球的合成及其在分离纯化菠萝蛋白酶中的应用，属于天然产物有效成分的分离纯化技术领域。

背景技术

菠萝蛋白酶是分离于菠萝的茎和果实中的一类纯天然植物蛋白酶，具有较强的分解蛋白质的能力，且具有酰胺键和酯键的特性，被广泛应用于医药，食品、饲料和美容保健等行业。在医药领域，其能够有效抑制血小板聚集，增进药物吸收和抗癌，在各种组织中治疗炎症和水肿等多种功效；在食品工业方面，菠萝蛋白酶被用作肉类嫰化剂，使得食物更容易被人体吸收；在饲料方面，将菠萝蛋白酶加入饲料配方中可预防动物腹泻尤其是仔猪的腹泻。

目前，工业上菠萝蛋白酶的提取方法主要有高岭土吸附法，单宁沉淀法和超滤浓缩法，但这些方法都各自存在一些不足之处，如生产工艺和操作复杂，酶活回收率低，污染环境，对技术要求较高，涉及到超滤膜的使用，生产成本高等。因此，寻求一种新的分离、提纯菠萝蛋白酶的方法是有必要的。

聚合物大分子修饰的磁性微球，不仅具有纳米材料所特有的如小尺寸效应、表面积效应、量子效应等，又具有良好的磁导向性、超顺磁性和生物相容性，且聚合物大分子修饰后的磁性纳米材料能够更大程度的防止粒子之间相互聚集，增强其分散性和稳定性，便于保存和应用。不同功能化的聚合物大分子可赋予磁性微球不同的作用功能，这种特定功能化的聚合物复合微球可以实现从复杂的样品中快速分离出目标物，且操作简便，可实现循环利用，节约成本。

本发明采用蒸馏沉淀聚合反应将温敏单体N-异丙基丙烯酰胺（NIPAM）与带环氧基单体甲基丙烯酸缩水甘油酯（GMA）共聚在四氧化三铁表面，相比较传统的沉淀聚合方法，在此反应中无须加入稳定剂、分散剂，整个反应时间小于两个小时，大大缩短了反应周期，提高反应效率。最后将该材料运用于从实际菠萝皮粗提取液中提取菠萝蛋白酶，通过SDS-PAGE凝胶电泳证明分离纯化得到的菠萝蛋白酶已达到了电泳纯。

发明内容

本发明的主要目的是克服现有技术中存在的生产工艺和操作复杂，酶活回收率低，污染环境，对技术要求较高，，生产成本高等技术缺陷，提供一种新型的聚合物大分子共聚修饰的磁性微球及其合成方法，并将该磁性微球应用于分离纯化菠萝蛋白酶，同时实现对菠萝蛋白酶的热保护作用。

本发明采取的技术手段如下：

本发明首先提供一种核壳式磁性复合微球，即一种新型的聚合物大分子共聚修饰的磁性微球，所述微球记为Fe₃O₄@P(GMA-co-NIPAM)/IDA/Ni²⁺，所述微球比表面积大，粒径大小均一，都保持在200 nm左右。

本发明还提供该磁性微球的制备方法，具体步骤如下：

（1）磁性温敏聚合物Fe₃O₄@P(GMA-co-NIPAM)的合成：

MPS修饰Fe₃O₄，使得Fe₃O₄表面修饰了双键，得到复合材料Fe₃O₄/MPS；

取Fe₃O₄/MPS于三口烧瓶中，加入乙腈超声分散5 min，加入N-异丙基丙烯酰胺（NIPAM）、甲基丙烯酸缩水甘油酯（GMA）、交联剂N,N'-亚甲基双丙烯酰胺（MBA）、引发剂偶氮二异丁腈（AIBN）混合均匀后，安装分馏柱，冷凝管，接收器；机械搅拌并通氮气，油浴加热烧瓶蒸馏得到部分乙腈，停止反应；得到的产物用磁铁分离，并用乙醇和水反复洗涤后放入真空干燥箱内干燥。

其中，所述Fe₃O₄/MPS的合成方法参考文献（Yuting Zhang, Dian Li, Meng Yu, et al. Fe₃O₄/PVIM-Ni²⁺ Magnetic Composite Microspheres for Highly Specific Separation of Histidine-Rich Proteins [J]. ACS applied materials & interfaces, 2014, 6(11): 8836-8844.）