[发明专利]一种产虾青素基因工程菌的构建方法

说明书

本发明专利申请是申请号为“2014104472590”的发明专利的分案申请，原申请的申请日为“2014.09.03”，申请号为“2014104472590”，发明名称为“鞘氨醇单胞菌的虾青素合成酶及其编码基因和鞘氨醇单胞菌遗传操作的方法”。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种产虾青素基因工程菌的构建方法。

背景技术

虾青素（Astaxanthin，又称变胞藻黄素或虾红素），属于酮式类胡萝卜素，是一种较强的天然抗氧化剂。其独特的分子结构不但使其具有超强的抗氧化活性，还具有抗衰老、抗辐射、抗肿瘤及预防心脑血管疾病的作用。目前，虾青素已在食品、饲料、保健品市场等广泛应用。然而天然虾青素的来源非常有限，目前，虾青素大多采用传统突变技术产生的Pfaffia菌株和微藻生产，但是，Pfaffia发酵存在发酵周期长的缺点，而从藻类中获得产物的生产技术仍不成熟。因此，开发新的天然虾青素资源具有重要意义。

鞘氨醇单胞菌是革兰氏阴性菌，1990年被鉴定，专性需氧，以单侧生极性鞭毛运动，多呈黄色。其黄色菌落多是由于产生类胡萝卜素导致。细胞膜与一般的革兰氏阴性菌不同，为鞘糖脂，这也使得对其的遗传操作还未成熟。目前，在Sphingomonas ATCC 55669中尚无任何基因方面的信息报道，也未有相关遗传操作的文献，即使是该菌株所在的属也鲜有报道。目前，鞘氨醇单胞菌多可降解多元化的芳环化合物，是环境微生物的研究热点，其遗传操作的建立为进一步利用其降解机制建立了基础。

虾青素生物合成途径已被广泛研究并取得了巨大进展，大量关键酶基因得到克隆。目前已知的类胡萝卜素均通过类异戊二烯化合物或萜类化合物途径合成。其中，非甲羟戊酸途径MEP（nonmevalonate pathway）途径广泛存在于细菌中，它以糖酵解中间代谢物丙酮酸和3-磷酸甘油醛为前体，在脱氧木酮糖磷酸合酶作用下生成脱氧木酮糖磷酸，然后受脱氧木酮糖磷酸还原酶和异构酶催化，通过还原和异构反应将脱氧木酮糖磷酸转变成2-甲基赤藓糖醇-4-磷酸（MEP）。经胞苷三磷酸活化，腺苷三磷酸磷酸化，从而形成甲基赤藓糖醇环化焦磷酸，然后转变成IPP（异戊烯焦磷酸），IPP 异构化形成DMAPP（二甲基丙烯基二磷酸）。IPP和DMAPP是合成虾青素途径的前体物质。两者在IPP异构酶作用下相互转换达到平衡，在crtE（牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶）作用下，1个DMAPP与3个IPP 分子缩合生成GGPP（牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸）。2分子GGPP在crtB（八氢番茄红素合成酶）作用下形成第一个无色的类胡萝卜素——八氢番茄红素。八氢番茄红素经过连续的脱氢步骤（crtI）生成番茄红素。番茄红素在crtY（番茄红素β-环化酶）的作用下生成β-胡萝卜素。β-胡萝卜素在crtZ（β-胡萝卜素羟化酶）和crtW（β-胡萝卜素酮酶）的一系列作用下生成虾青素（如图1）。

通过丰富不同来源的虾青素生物合成相关基因，经重组DNA技术筛选，从而增加虾青素生物合成的生产能力，是缩短发酵周期，提高虾青素生物合成产率的重要途径，从而为虾青素进一步工业化生产打下基础。

发明内容

本发明的目的在于提供一种产虾青素基因工程菌的构建方法以及通过该方法得到的基因工程菌。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种产虾青素基因工程菌的构建方法，包括如下步骤：将产虾青素质粒pFZ153转化内含质粒pMH1、pFZ81的MG1655大肠杆菌感受态细胞，得到产虾青素基因工程菌；其中，产虾青素质粒pFZ153通过包括如下步骤的方法得到：

（1）大肠杆菌来源的idi基因通过PCR扩增克隆到载体pET28a（+）上获得质粒pGZI，将idi基因片段从pGZI中用NdeI和XhoI切下插入到pETduet-1相应位点获得pFZ87。

（2）以pFZ87为模板用引物PagCrtY-Idi-R和PagCrtW-pETduet-F扩增质粒骨架；

从CGMCC 1.2244基因组DNA扩增crtY和crtZ，引物分别为Idi-PagCrtY-F、CrtZ-PagCrtY-R，CrtY-PagCrtZ-F、CrtW-PagCrtZ-R；

合成SEQ ID NO.1所示的CrtW，以其为模板用引物CrtZ-BreCrtW-F和BreCrtW-R扩增crtW；