[发明专利]一种镉污染底泥的微生物修复方法

权利要求书

1.一种镉污染底泥的微生物修复方法，其特征在于，包括以下两个步骤，

步骤一：针对镉污染底泥的硫酸盐还原菌的富集、驯化与扩大培养；

（1）培养基：KH₂PO₄ 0.5 g/L，NH₄Cl 1 g/L，CaSO₄ 1 g/L，MgSO₄·7H₂O 2 g/L，乳酸3.5g/L，酵母膏1 g/L，抗坏血酸0.1 g/L，巯基醋酸0.1 g/L，FeSO₄·7H₂O 0.5 g/L，超纯水1 L，调节pH在7.0~7.5之间；

（2）菌种富集：挑取2 g水库天然底泥样品，放入50 mL具塞玻璃管中，加入9 mL的0.75%的生理盐水，得到10^-1的稀释液；摇匀后，吸取2 mL的底泥稀释液加入到灭菌后的含有300mL培养基的锥形瓶中；用封口膜密封锥形瓶，将其放入30℃恒温培养箱中培养；2~3天后，富集到SRB菌液；

（3）菌种驯化：吸取15 mL富集得到的SRB菌液加入到另一个300 mL的培养基中，进行下一次纯化培养，如此重复操作三次纯化培养；

（4）菌种扩大培养：按上述（1）中的培养基配方称取各组分后，使用超纯水定容到1 L，轻摇，待药品充分溶解后，转移到300 mL锥形瓶中，用铝箔纸封口，放入高压蒸汽灭菌锅中灭菌后备用，灭菌条件为121℃，20 min；其中，巯基醋酸和抗坏血酸需要单独配制成质量百分比含量为10%的溶液，进行高压蒸汽灭菌；每300 mL培养基中加入15 mL驯化后的SRB菌液进行扩大培养，待出现黑色后即可用于底泥修复；

步骤二：硫酸盐还原菌修复Cd污染底泥；

在室温条件下，先将湿重为800 g的底泥装入2000 mL烧杯中；加入超纯水定容至1800mL；然后加入步骤一中扩大培养的菌液300 mL；匀速搅拌使培养基与底泥充分混合；烧杯经保鲜膜密封后，放置在30℃的生化培养箱中，进行为期166天的修复；利用修复前后底泥间隙水的镉含量并利用改进的Tessier连续提取法对修复前后的底泥进行Cd化学形态分析来评价修复效果，可知，底泥孔隙水Cd含量明显降低，底泥中非稳定态Cd含量明显减少，而相对稳定态Cd含量增加；所述的SRB菌液为复合菌，在科水平上，所述复合菌包括紫单胞菌科、毛螺菌科、梭菌科1、脱硫弧菌科、芽胞杆菌科、疣微菌科、梭菌目XI科、拟杆菌科、克里斯滕森菌科；其中，脱硫弧菌在脱硫弧菌目、脱疏弧菌科和脱硫弧菌属水平上的细菌丰度为8.28%。

2.根据权利要求1所述的一种镉污染底泥的微生物修复方法，其特征在于，在步骤二中，利用修复前后底泥间隙水的镉含量并利用改进的Tessier连续提取法对修复前后的底泥进行Cd化学形态分析来评价修复效果，可知，底泥孔隙水Cd含量明显降低，底泥中可交换态Cd含量明显减少，而铁锰氧化物结合态和有机物结合态Cd含量增加。

3.根据权利要求1或2所述的一种镉污染底泥的微生物修复方法，其特征在于，所述改进的Tessier连续提取法，具体操作步骤如下：

①可交换态：称取1.000 g底泥至50 mL离心管中，加入1 mol/L的MgCl₂溶液8 mL，在25±1℃下振荡提取1 h后，离心，用5 mL移液枪取4 mL上清液；向提取液中加入1 mL 70%的浓硝酸，摇匀，之后将消解管放到消解炉上以140℃加热至完全干燥为止，待温度降到70℃时再加入2%的HNO₃后定容到8 mL，待测；用16 mL超纯水洗涤残余物，离心，弃去上清液，重复操作洗涤三次，洗涤后的残渣经-18℃冷冻后用于下一步提取；

②碳酸盐结合态：将步骤①提取后的冷冻残渣，加入1 mol/L的NaOAc溶液8 mL，在25±1℃条件下振荡提取5 h后，离心，用5 mL移液枪取1 mL上清液；向提取液中加入1 mL70%的浓硝酸，摇匀，之后将消解管放到自制消解炉上以140℃加热至完全干燥为止，待温度降到70℃左右时再加入2%的HNO₃后定容到8 mL，待测；用16 mL超纯水洗涤残余物，离心，弃去上清液，重复操作洗涤三次，洗涤后的残渣经-18℃冷冻后用于下一步提取；

③铁锰氧化物结合态：在步骤②提取后的冷冻残渣中，加入20 mL 0.04 mol/L的NH₂OH•HCl的25%HAc溶液，在96±3℃条件下振荡提取6 h，冷却离心，用5 mL移液枪取15 mL上清液；向提取液中加入1 mL70%的浓硝酸，摇匀，之后将消解管放到自制消解炉上以140℃加热至完全干燥为止，待温度降到70℃左右时再加入2%的HNO₃后定容到8 mL，待测；用16 mL超纯水洗涤残余物，离心，弃去上清液，重复操作洗涤三次，洗涤后的残渣经-18℃冷冻后用于下一步提取；

④有机物结合态：在步骤③提取后的冷冻残渣中，加入3mL 0.02mol/L的 HNO₃的溶液，再加入5mL 30%的 H₂O₂，85±2℃条件下振荡提取2 h后，加入3 mL 30%的H₂O₂，在85±2℃条件下再振荡提取3 h，冷却至25±1℃，加入5 mL 3.2 mol/L的NH₄OAc的20% HNO₃溶液，并用超纯水稀释到20 mL后再振荡提取30 min，再次离心，取15 mL上清液；向提取液中加入1mL70%的浓硝酸，摇匀，之后将消解管放到自制消解炉上以140℃加热至完全干燥为止，待温度降到70℃左右时再加入2%的HNO₃后定容到8 mL，待测；用16 mL超纯水洗涤残余物，离心，弃去上清液，重复操作洗涤三次，洗涤后的残渣经-18℃冷冻后用于下一步提取；

⑤残渣态：将步骤④提取后的冷冻残渣转移至消解管中，依次加入65%~68%的HNO₃ 1mL和70%~72% HClO₄ 4 mL，加完之后按照以下的加热程序方式进行：50℃加热3 h，70℃加热0.5 h，100℃加热0.5 h，150℃加热3 h，190℃加热至完全干燥；待温度降到70℃左右时再加入2%的HNO₃后定容到8 mL，离心，取上清液待测。