[发明专利]赖氨酸脱羧酶突变体文库构建及高或低活力突变株高通量筛选的方法

说明书

本发明涉及生物酶突变体文库构建及高或低活力突变株高通量筛选的方法，具体涉及适用于长度高于2000bp的基因如赖氨酸脱羧酶基因的易错PCR定向进化突变体文库的构建方法及高或低活力突变株高通量筛选的方法。本发明采用易错PCR分段突变、PCR整合、DpnI酶消化、系列pH指示剂指示pH变化的方法，解决了常规易错PCR方法无法有效构建长片段基因突变体文库、连接效率低、pH变化超过指示剂指示范围的难题，为从赖氨酸脱羧酶的突变体文库中筛选出酶活提高或降低的突变株提供了快速、简便的方法。

技术领域

本发明涉及生物酶突变体文库构建及高或低活力突变株高通量筛选的方法，具体涉及适用于长度高于2000bp的基因如赖氨酸脱羧酶基因的易错 PCR定向进化突变体文库的构建方法及高或低活力突变株高通量筛选的方法。

背景技术

戊二胺(1,5-戊二胺)，又叫尸胺，因其首次分离于腐败的尸体中因此得名。因为其在农业、医学及工业上具有广泛的应用而越来越受到关注。在工业上其可以与二元酸进行聚合反应生成新型尼龙—一种优质的高分子材料，用于替代对石油依赖度非常大的聚酰胺尼龙6.6。

戊二胺可以通过生物法制备，其方法主要有两种，一种是一步法制备，即通过细胞的自身代谢系统中的赖氨酸合成途径将葡萄糖转化成赖氨酸后再通过赖氨酸脱羧酶(EC4.1.1.18)将赖氨酸脱羧生成戊二胺，整个过程在细胞内统一完成；另一种方法是通过细胞表达大量的赖氨酸脱羧酶，然后在发酵液中添加外源的赖氨酸，使表达的赖氨酸脱羧酶将赖氨酸脱羧生成戊二胺。在这两种方法中，关键步骤之一是通过赖氨酸脱羧酶将赖氨酸上的羧基脱去，得到戊二胺。在这个过程中赖氨酸脱羧酶催化能力的高低直接影响赖氨酸脱羧的效率。为提高在催化过程中的催化效率，通常采取的办法可以包括增加酶量，但是这种方法增加了成本。另外由于一般使用的是含有酶的细胞，增加反应中的细胞量的会增加后处理的成本。

提高酶活是提高催化能力的另一种方法。提高酶活是指提高单位质量或重量的酶的催化活力或能力。提高酶活的方法有优化反应体系中的组分、pH 或者通过分子改造，对酶蛋白的氨基酸序列进行改造。分子改造赖氨酸脱羧酶可以有两种方法，一种是基于蛋白分子三维结构及催化机理的理性设计，包含理性计算、定点突变等；另一种是基于高通量筛选的定向进化。

定向进化是模仿达尔文进化论，人为地对蛋白分子进行随机的突变，构建突变体文库，再在人为的筛选压力下对突变体文库进行筛选，得到预期目标的突变体。易错PCR定向进化是构建突变体文库的最为简便基础的方法，其基本原理是通过调整反应体系中的锰离子、镁离子及四种不同的dNTPs改变taq酶的保真性，在使用taq酶扩增目标基因的过程中随机地引入突变。但是常规的基于taq酶的易错PCR也存在其缺点，主要是其适用于长度在1000bp左右的基因片段，而对于长度高于2000bp的基因则较难扩增出来。高通量筛选方法则是根据酶催化底物或产物特征，建立易于快速检测或区分的指示方法。

在一些需求中，则需要酶活适度降低的赖氨酸脱羧酶。

本领域依然存在对适用于构建基于易错PCR的长度高于2000bp的基因如赖氨酸脱羧酶基因的突变体文库的方法的需求，存在提高或降低赖氨酸脱羧酶酶活的迫切需求。

发明内容