[发明专利]一种用于人间充质干细胞的无血清培养基及其应用

说明书

技术领域

本发明属于干细胞培养技术领域，具体涉及一种用于人间充质干细胞的无血清培养基，本发明还涉及利用该培养基分离、纯化培养人间质干细胞的方法。

背景技术

细胞治疗己成为生物治疗领域中最活跃的一个部分，规范化的细胞治疗研究已成为现代医学的重要组成。当前我国细胞治疗中常用的细胞类型是成体来源的细胞，如免疫细胞、骨髓干细胞、脐血和脐带来源的造血或间充质干细胞等。

间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)来源广泛，也较易于分离、培养、扩增和纯化，免疫原性低，无道德伦理问题的限制，所以在免疫治疗和基因治疗方面有着巨大的应用前景。如自体或异基因骨髓或脐血造血干细胞移植用于治疗血液病、恶性肿瘤等；或骨髓和脐带来源的间充质干细胞经移植后转化为肝样细胞、成骨细胞、心肌细胞、汗腺细胞等。

目前，用于间充质干细胞的分离、纯化培养的培养基主要是在基础培养基的基本上添加一定浓度的动物血清如胎牛血清（FBS），动物血清含有异种蛋白质，使用动物血清培养和扩增的自体间充质干细胞在用于临床治疗时，可致受者体内产生抗体，从而引起免疫反应。因此，不含血清的培养基成为人们研究的热点。如中国专利“一种间充质干细胞无血清培养基”（申请号为201110420539.9，公告号为CN102433302A）公开了一种主要由碱性成纤维细胞生长因子、人表皮细胞生长因子、重组人胰岛素、人血白蛋白、亚硒酸钠、左旋卡尼丁和白藜芦醇等组分组成的培养基，该培养基不含血清，含有多种生长因子，并且通过加入左旋卡尼丁和白藜芦醇可有效改善间充质干细胞生长状态。但是，该无血清培养基只能将脐带间充质干细胞数目扩增大约 1000倍，其专利说明书中也只提及了使用该培养基用于脐带间充质干细胞最多经过10次传代培养时，能够保证脐带间充质干细胞的生物学特性不变。

与上例相同，目前可见的间充质干细胞无血清培养培养技术普遍存在着培养成本高、扩增数量有限[扩增数量一般可在(1-2)×10⁸]、扩增时间长、干细胞易分化等不足，直接影响临床应用的安全性。保持人间充质干细胞的干性（即原始未分化性），并大量扩增，从而应用于临床研究是细胞治疗研究的重要内容之一。但是为能够实现该方法的临床有效应用，对该人间充质干细胞的有效的规模化培养并保持其干性则成为了主要难题。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种用于分离、纯化培养人间充质干细胞的无血清培养基，该无血清培养基能提高人间充质干细胞的分离纯化效率，以该无血清培养基为基础加入亚油酸（LA）、人源AB型血清、血小板衍生生长因子（PDGF）、表皮细胞生长因子（EGF）用于人间充质干细胞扩增培养时，可提高扩增速度、减少扩增时间，并能始终保持干细胞的干性。

本发明所采用的技术方案如下：

一种用于人间充质干细胞的无血清培养基，其特征在于，所述培养基组分包括基础培养基、MCDB、胰岛素铁硒传递蛋白（ITS）、人血清白蛋白（HSA）、青链霉素（Pen/strep）以及地塞米松（DEX）；所述基础培养基为DMEM培养基。上述无血清培养基以1升计算，各组分的用量如下：

MCDB 20~100ml、胰岛素铁硒传递蛋白（ITS）50~400μl、人血清白蛋白（HSA）50~100μl、青链霉素（Pen/strep）0.5~2ml、 地塞米松（DEX）5~20μl、余下为基础培养基。

进一步地，上述无血清培养基以1升计算，各组分的用量优选为：

MCDB 50ml、胰岛素铁硒传递蛋白（ITS）200μl、人血清白蛋白（HSA）60μl、青链霉素（Pen/strep）1ml、地塞米松（DEX）10μl、余下为基础培养基。

本发明用于人间充质干细胞的培养方法，包括如下步骤：

1）人间充质干细胞原代分离培养

自人脐带分离出人间充质干细胞后，或自骨髓血或脐带血分离出单个核细胞后，于上述组分的无血清培养基中进行分离纯化培养；

2）扩增多次传代培养

将步骤1）原代分离培养得到的间充质干细胞，于如下组分的扩增培养基进行扩增传代培养：

MCDB 20~100ml、胰岛素铁硒传递蛋白（ITS）50~400μl、人血清白蛋白（HSA）50~100μl、青链霉素（Pen/strep）0.5~2ml、 地塞米松（DEX）5~20μl、亚油酸（LA）1~10ml、人源AB型血清 1~10ml、血小板衍生生长因子（PDGF）