[发明专利]一种用于人间充质干细胞的无血清培养基及其应用

权利要求书

1.一种用于人间充质干细胞的无血清培养基，其特征在于，所述培养基组分包括基础培养基、MCDB、胰岛素铁硒传递蛋白、人血清白蛋白、青链霉素以及地塞米松；所述基础培养基为DMEM培养基。

2. 如权利要求1所述的一种用于人间充质干细胞的无血清培养基，其特征在于，所述培养基以1升计算，各组分的用量如下：

MCDB 20~100ml

胰岛素铁硒传递蛋白 50~400μl

人血清白蛋白 50~100μl

青链霉素 0.5~2ml

地塞米松 5~20μl

余下为基础培养基。

3.如权利要求1所述的一种用于人间充质干细胞的无血清培养基，其特征在于，所述培养基以1升计算，各组分的用量如下：

MCDB 50ml

胰岛素铁硒传递蛋白 200μl

人血清白蛋白 60μl

青链霉素 1ml

地塞米松 10μl

余下为基础培养基。

4.一种将权利要求1至3任一项所述无血清培养基的应用，其特征在于，包括如下步骤：

1）人间充质干细胞原代分离培养

自人脐带分离出人间充质干细胞后，或自骨髓血或脐带血分离出单个核细胞后，于如下组分的培养基中进行分离纯化培养：

MCDB 20~100ml

胰岛素铁硒传递蛋白 50~400μl

人血清白蛋白 50~100μl

青链霉素 0.5~2ml

地塞米松 5~20μl

余下为基础培养基；

2）扩增多次传代培养

将步骤1）原代分离培养得到的间充质干细胞，于如下组分的扩增培养基进行扩增传代培养：

MCDB 20~100ml

胰岛素铁硒传递蛋白 50~400μl

人血清白蛋白 50~100μl

青链霉素 0.5~2ml

地塞米松 5~20μl

亚油酸 1~10ml

人源AB型血清 1~10ml

血小板衍生生长因子 10~100μl

表皮细胞生长因子 50~100μl

余下为基础培养基。

5.如权利要求4所述无血清培养基的应用，其特征在于所述步骤1）人间充质干细胞原代分离培养为自人脐带分离人间充质干细胞，釆用贴壁法，包括如下步骤：

1）将剪碎的间距在0.2~0.5cm的脐带小块均匀平铺在培养皿中；翻转培养瓶置37℃ 4~6h；

2）4~6h后正置培养瓶，培养12h过夜；

3) 7~10天时观察细胞爬出情况，换液1~2次将组织块弃去，补足培养基继续培养至可传代。

6.如权利要求4所述无血清培养基的应用，其特征在于所述步骤1）人间充质干细胞原代分离培养为自人脐带分离人间充质干细胞，釆用酶消化法，包括如下步骤：

1）将剪碎的脐带装入血清瓶中，加Ⅱ型胶原酶2ml、PBS 2ml，混匀后封口，置37℃过夜，过夜期间每隔2~6混匀；

2）次日，取消化好的组织块，取上清移置于新管；

3）加1ml0.25%胰酶，置37℃消化5min；

4）加1ml培养干细胞培养基终止消化，补PBS至10ml；

5）3000~4000 rpm离心10min；

6）弃去上清，加1ml培养干细胞培养基重悬沉淀，接种到培养皿，补足培养基培养；

7）每两天观察，每3天半量更换培养基，培养至可传代。

7.如权利要求4所述无血清培养基的应用，其特征在于所述步骤1）人间充质干细胞原代分离培养为自骨髓血或脐带血分离单个核细胞，釆用梯度离心法，包括如下步骤：

1）采集人骨髓血或健康脐带血50ml，利用淋巴细胞分离液分离，收集单个核细胞；

2）置于培养干细胞培养基，调整细胞浓度为3×10⁶/mL，37℃、5％CO₂孵育24小时后收集贴壁细胞即得到分离纯化的间充质干细胞。