[发明专利]一种高产哈茨木霉α-1,3-葡聚糖酶的重组菌及其应用

说明书

本发明公开了一种高产哈茨木霉α‑1,3‑葡聚糖酶的重组菌及其应用。本发明对来自哈茨木霉CCM F‑340的α‑1,3‑葡聚糖酶基因进行密码子优化，采用里氏木霉cbh1强启动子及其信号肽序列和cbh1终止子，以pyr4基因为筛选标记基因构建了α‑1,3‑葡聚糖酶表达载体pSK‑mutAW，并在里氏木霉中实现了哈茨木霉α‑1,3‑葡聚糖酶的高效分泌表达。通过实验证明：重组表达的哈茨木霉α‑1,3‑葡聚糖酶能有效降解非水溶性葡聚糖mutan，发酵液酶活力单位可达到2.3U/ml，发酵液中α‑1,3‑葡聚糖酶含量约为68ug/ml，且本发明的发酵工艺和目标蛋白纯化工艺简单，非常适合工业生产及应用。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种高产哈茨木霉α-1,3-葡聚糖酶的重组菌及其应用。

背景技术

口腔牙菌斑是一种高度多样化和复杂的生物膜，牙菌斑是齿龈炎、牙周炎、龋齿等口腔疾病的重要病因。目前，常用的牙菌斑控制方法有机械法和药物法。机械法主要有刷牙和使用牙线、牙签等。药物法则是利用一些化学药物来去除或抑制牙菌斑的形成。目前市场上主要使用的化学药物为洗必泰。洗必泰具有很好的抗菌活性，但长期使用容易导致口腔中有益菌群的破坏和耐药菌的富集。

多糖是牙菌斑基质中的关键成分，可作为抗牙菌斑试剂的重要靶点，使用特异性多糖水解酶降解牙菌斑多糖基质，控制菌斑在牙面上的形成和聚集，是牙菌斑控制的又一途径。非水溶性葡聚糖(mutan)是由口腔链球菌分泌的糖基转移酶催化蔗糖形成的，非水溶性葡聚糖含有高比例的α-1,3糖苷键，因其水不溶性和粘附性，在致龋菌的粘附、牙菌斑的形成和阻碍牙菌斑中酸性物质的扩散中起着重要作用，是口腔变形链球菌致龋的重要毒力因子之一。α-1,3-葡聚糖酶(α-(1→3)-glucanase，EC3.2.1.84)能够特异性催化α-1,3糖苷键的水解，应用α-1,3-葡聚糖酶减少或清除牙菌斑的作用已见报道，是一种极具潜力的、科学安全的生物防龋新方法。α-1,3-葡聚糖酶来源于细菌和真菌，其中木霉属是α-1,3-葡聚糖酶的重要来源。在大多数菌中α-1,3-葡聚糖酶是诱导型表达的，通常在富含α-1,3糖苷键的葡聚糖存在的条件下表达。利用天然菌株发酵生产α-1,3-葡聚糖酶，存在目标蛋白产量低、诱导物来源受限及蛋白纯化工艺繁琐等问题。目前在不同表达系统中α-1,3-葡聚糖酶表达水平也普遍不高(见表1)，Wiater A等人以原始哈茨木霉CCM F-340菌株进行摇瓶发酵，发酵液的最高酶活为0.82U/ml(Wiater A et al,2012)，且需要专门制备硫磺菌子实体细胞壁提取物作为诱导物。Wiater A等人采用大肠杆菌表达系统表达哈茨木霉CCM F-340来源的α-1,3-葡聚糖酶，α-1,3-葡聚糖酶的酶活力仅为0.097U/mg(Wiater A et al,2011)。因此开发安全性高、发酵提纯工艺简单、成本低的新表达系统来高效表达α-1,3-葡聚糖酶是十分必要的。

表1、不同宿主表达α-1,3-葡聚糖酶的相关研究

发明内容

本发明的一个目的是提供一种重组菌。

本发明提供的重组菌是将哈茨木霉α-1,3-葡聚糖酶的编码基因导入宿主里氏木霉菌Trichoderma reesei，得到的菌。

上述重组菌中，所述哈茨木霉α-1,3-葡聚糖酶的编码基因是通过表达哈茨木霉α-1,3-葡聚糖酶的重组载体导入宿主里氏木霉菌。

上述重组菌中，所述表达哈茨木霉α-1,3-葡聚糖酶的重组载体为pSK-mutAW重组载体；

所述pSK-mutAW重组载体是将所述哈茨木霉α-1,3-葡聚糖酶的编码基因插入骨架载体的多克隆位点得到的；所述骨架载体具体为pSK-Lip，其含有大小为1904bp的cbh1启动子、大小为51bp的cbh1信号肽和大小为2243bp的Tcbh1终止子。