[发明专利]一种利用双信号技术的电化学DNA生物传感器及其制备方法和应用方法

权利要求书

1.一种利用双信号技术的电化学DNA生物传感器，其特征在于，该传感器以金电极作为基底电极，二茂铁标记的巯基化电化学分子信标探针SH-DNA-Fc通过金硫键修饰在基底电极上，所述SH-DNA-Fc上修饰有生物素修饰的报告DNA-目标DNA杂交复合物，所述生物素修饰的报告DNA上修饰有链霉亲和素修饰的辣根过氧化酶；该传感器以辣根过氧化酶和二茂铁作为电化学双信号，能够特异性的检测分析三核苷酸重复序列d(CAG)_n的序列和确定重复数目n，所述三核苷酸重复序列为目标DNA,其中所述的巯基化电化学分子信标探针SH-DNA-Fc的序列为5’-SH-(CH₂)₆-GCAGTGCATGCTCGTAGTCGCACT-Fc-3’；所述的报告DNA序列为5’-CTGCTGCTGCTGCTGTTTTTT-biotin-3’。

2.一种利用权利要求1所述电化学DNA生物传感器的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

（1）DNA溶液的配制：用tris-HCl缓冲液将SH-DNA-Fc配制成浓度为0.5μM的SH-DNA-Fc探针溶液，用tris-HCl缓冲液将生物素修饰的DNA即报告DNA配制成浓度为2μM的报告DNA溶液；

（2）SH-DNA-Fc探针修饰金电极的制备：将金电极浸泡在步骤（1）所述的SH-DNA-Fc探针溶液中进行探针修饰，得到修饰完的金电极；将所述修饰完的金电极进行封闭，得到所述的SH-DNA-Fc探针修饰金电极；

（3）目标DNA的捕获：将步骤(2)所得到的SH-DNA-Fc探针修饰金电极浸泡在含有目标DNA和报告DNA的杂交溶液中，反应后，目标DNA被捕获到金电极表面，得到dsDNA修饰的金电极；

（4）双信号电化学DNA生物传感器工作电极的制备：将链霉亲和素修饰的辣根过氧化酶滴加至步骤（3）制备的dsDNA修饰的金电极表面上，杂交反应后，得到酶标记的dsDNA修饰的金电极，即双信号电化学DNA生物传感器工作电极；

（5）检测底液的制备：取PB缓冲溶液、双氧水和TMB溶液加入到检测池中，混合均匀即得到检测底液；

（6）双信号电化学DNA生物传感器进行检测的方法：将步骤（4）得到的双信号电化学DNA生物传感器工作电极、饱和甘汞电极和铂电极构成三电极体系插入步骤（5）制备的检测底液中，进行检测。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，tris-HCl缓冲液为三（羟甲基）氨基甲烷溶液，其浓度为0.1M,调节pH至7.4。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，在进行探针修饰时，反应温度为20～35℃，修饰反应的时间为10～16小时。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的修饰反应时间为12小时。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述封闭是指使用浓度为1mM的巯基己醇进行封闭。

7.根据权利要求2-4中任意一项所述的方法，其特征在于，步骤（3）中，反应的温度为37℃，反应时间为1小时。

8. 根据权利要求2-4中任意一项所述的方法，其特征在于，步骤（3）中，所述报告DNA溶液的浓度为1.5～3 μM。

9.根据权利要求2-4中任意一项所述的方法，其特征在于，步骤（4）中，反应温度为20～37℃，反应时间为0.5～1小时；所述链霉亲和素修饰的辣根过氧化酶，浓度为1～3 μM。

10.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（5）中，检测底液的制备具体包括：分别取4mL的0.1M PB缓冲溶液、10μL的双氧水和10μL的TMB溶液加入到检测池中，混合均匀即得到检测底液。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述的检测方法包括电化学测定；利用循环伏安法、电化学阻抗、方波伏安法和电流-时间法进行扫描，根据电化学信号数据绘制标准曲线图；利用酶催化信号与二茂铁信号的比值，确定n值的大小。